国家自然科学基金(30170005)
- 作品数：11 被引量：65H指数：5
- 相关作者：袁生赵庆新余多慰张宇玲陆长梅更多>>
- 相关机构：南京师范大学盐城师范学院更多>>
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- XynⅢ包涵体的纯化与变复性研究被引量：8
- 2004年
- 常规诱导表达后收集的粗包涵体经 3mol/L尿素洗涤加上表面活性剂TritonX -10 0作用 ,可将包涵体中xynⅢ的含量从 3 7%提高到 92 .4% ;8mol/L尿素可将包涵体完全溶解 ;蛋白浓度在 0 .2～ 0 .2 5mg/mL时 ,pH4.5 5 0mmol/LNaOAc与pH 7.5 2 0mmol/LTris HCl缓冲液复性效果相当 ;降低蛋白浓度 ,则是pH 7.5 2 0mmol/LTris HCl缓冲液复性效果相对较好 ;复性过程中加入DTT、EDTA、尿素、木糖等处理复性效果没有明显提高 ;pH7.5 2 0mmol/LTris HCl、0 .0 1mg/mL蛋白浓度条件下 。
- 陆长梅李继影陈阳袁生
- 绿色木霉纤维二糖水解酶Ⅱ的X射线辐射损伤研究被引量：1
- 2007年
- 南京师范大学生命科学学院,江苏南京210097摘要根据半胱氨酸相关的拉曼光谱分析指标,采用X光管1.82keV,40mA,处理4h的辐射条件,水溶液中绿色木霉纤维二糖水解酶Ⅱ的各种S—H伸缩振动拉曼谱带虽然偏移不多,但呈现了二极分化的演变状态。辐照后的样品中2554cm-1峰宽加大。辐照没有引起维系高级空间结构存在的二硫键断裂,二硫键键长有缩小变化,二硫键几何构象类型未改变,但各种异构体成分的相对含量有变化,辐射前半胱氨酸C—S键异构体特征模PC型略多,辐射后PN和PH型增多。除半胱氨酸CH2摇摆的贡献在辐射后有明显减弱外,此辐射条件没有造成拉曼技术所能证明的与巯基有关的蛋白结构的明显损伤,但可见有变化存在。
- 余多慰袁生
- 关键词：半胱氨酸拉曼光谱
- 米曲霉(Aspergillus oryzae)果胶酸内切水解酶(PGA)在原核系统中重组表达被引量：1
- 2007年
- 果胶酶具有广阔的商业用途,在食品工业上主要用于果汁和酒类的澄清、提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纤维脱胶。米曲霉(Aspergillusoryzae)一直用于传统发酵食品的生产,自然条件下其果胶酶的产量较低。文献报道的果胶酶的重组表达成功的例子较少,且活性较低。通过RT-PCR的方法,获得不含信号肽的果胶酸内切水解酶A(polygalacturonaseA,PGA)的cDNA,PGAcDNA连入pET-28a(+)载体,构建pET-28a(+)-pga质粒。pET-28a(+)-pga转化Turner(DE3)placⅠ细胞,得到转化子pET-28a(+)-pga-Turner(DE3)placⅠ,首次实现了米曲霉PGA在大肠杆菌系统中过表达,进一步对PGA在大肠杆菌系统中表达的条件进行了研究。在37℃、220r/min条件培养pET-28a(+)-pga-Turner(DE3)placⅠ细胞,OD600至0·8左右时,用500μmol/Lisopropylβ-D-thiogalactogalactopyranoside(IPTG)进行诱导表达,在15℃和170r/min条件下继续培养24h,表达效果最好,相对于每毫升培养基而言,产酶可达到70u/mL,是米曲霉自然条件产酶量的87·5倍,远优于文献报道的重组表达的PGA酶活。
- 张宇玲赵庆新朱泓孙静韩丰敏袁生
- 关键词：米曲霉原核表达
- 绿色木霉纤维素酶分子内氢键特征的研究被引量：14
- 2005年
- 运用能够揭示蛋白质分子基团振动特征的激光拉曼光谱分析技术,对绿色木霉纤维素酶中的CBHⅡ在固态以及两种pH值的液态中酶分子内的氢键状态进行了分析。结果表明相对于纤维素酶固体干粉,液态中酶分子酰胺Ⅰ羰基氧原子作为氢键质子受体的能力为上升;酰胺Ⅱ与酰胺Ⅰ的β结构特征峰变化倾向相似。在3种样品中,酶蛋白中Trp均为强氢键供体,从成键能力方面证实了以往同类酶空间分析的结果。固体与pH 6 0水溶液酶蛋白中酪氨酸酚羟基成键能力也是强的。根据游离巯基分析可以判断绿色木霉CBHⅡ的成熟肽CBD与瑞氏木霉CBHⅡ的CBD有相似的二硫键构成。
- 余多慰袁生
- 关键词：纤维素酶绿色木霉分子内氢键成键能力激光拉曼瑞氏木霉
- 米曲霉果胶酸酯裂解酶(pectin lyase 1)在原核系统中重组表达被引量：2
- 2007年
- 来自米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)的果胶酸酯裂解酶(pectinlyase)一直被用于传统发酵食品的生产,但自然条件下A.oryzae和A.niger的果胶酸酯裂解酶产量较低。通过RT-PCR的方法,获得不含信号肽的A.oryzaePel1cDNA,将Pel1cDNA连入pET-28a(+)载体,构建pET-28a(+)-pel1质粒。pET-28a(+)-pel1转化Turner(DE3)placⅠ细胞,得到转化子pET-28a(+)-pel1-Turner(DE3)placⅠ,表达与6个组氨酸融合的Pel1。进一步对Pel1在E.coli系统中表达的条件进行了研究,在37℃,220r/min条件下,培养pET-28a(+)-pel1-Turner(DE3)placⅠ细胞,当OD600至0.8左右时,用500μmol/Lisopropylβ-D-thiogalactogalactop-yranoside(IPTG)进行诱导表达,在15℃和170r/min条件下,继续培养60h后,表达效果最好,产酶可达到400u/mL,是A.oryzae自然条件下产酶量的4000倍,也高于已报道的真菌果胶酸酯裂解酶在真菌体系中重组表达的效果。
- 赵庆新袁生张宇玲
- 关键词：米曲霉大肠杆菌
- 绿色木霉纤维素酶分子侧链构象与侧链环境特征的研究被引量：10
- 2004年
- 运用拉曼光谱分析技术能够揭示蛋白质分子基团振动特征 ,本文对绿色木霉 (Trichodermaviride)纤维素酶中的CBHⅡ在固态以及两种 pH值的液态中酶分子的侧链构象与侧链环境状态进行了拉曼分析。结果揭示了CBHⅡ中胱氨酸的CαCβ—S—S′—Cβ′Cα′基团和C—S键 ,蛋氨酸 (甲硫氨酸 )的CαCβ—Cγ—SC基团 ,HCβ—CγS基团和C—S键 ,以及半胱氨酸的HCβ—CγS基团和C—S键的构象特征。实验还证明14个色氨酸是部分暴露的 ,C2—C3—Cβ—Cα 侧链的扭转角[χ2.1]形式多样。在 pH6.0和固体样品中 ,酶蛋白中酪氨酸均为强氢键供体 ,两种样品各有20.3 %、25.1 %是暴露于溶剂的。而pH8.0水溶液中酪氨酸酚羟基成键能力特点是既可做氢键供体 ,又可做氢键受体 ,它们有80
- 余多慰袁生
- 关键词：绿色木霉纤维素酶构象拉曼光谱
- 番茄P56和部分来源多糖裂解酶家族Ⅰ的其它蛋白的系统演化分析被引量：1
- 2007年
- 果胶裂解酶包含果胶酸裂解酶(pectate lyase)和果胶酸酯裂解酶(pectin lyase)二种形式,是一类多糖裂解酶,由细菌、真菌、植物和线虫等生物产生,分布在5个多糖裂解酶家族,果胶酶在食品与饮料、纺织与洗涤、制药等工业中有广泛的应用。利用NCBI BLASTX服务器,搜索与番茄P56蛋白氨基酸序列相似且都属于多糖裂解酶家族Ⅰ的果胶裂解酶蛋白序列共28条,用DNAMAN软件分析其保守区,用CLUSTALX8.0软件进行序列比对和Bi-oEdit软件进行文件转换,进一步用PUAP4.0软件构建系统进化树。构建的MP树(phylogenetic trees)和NJ树(neighbor-joining)显示:来自植物的果胶酸裂解酶、真菌的果胶酸酯裂解酶、细菌的果胶酸裂解酶分别可聚为一个独立的类群;相对于细菌果胶酸裂解酶和真菌果胶酸酯裂解酶而言,构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的果胶酸裂解酶A和植物的果胶酸裂解酶之间有较近的亲缘关系;细菌Pseudomonas syringae的果胶酸酯裂解酶和真菌的果胶酸酯裂解酶之间的亲缘关系较近。
- 赵庆新张宇玲
- 植物细胞壁研究进展被引量：25
- 2007年
- 植物细胞壁是一种复杂的网状结构,其成分包含纤维素、半纤维素、果胶和少量的结构蛋白等。在植物细胞生长过程中,细胞能产生伸展素蛋白,打断纤维素和半纤维素之间的氢键,引起细胞膨压驱动的细胞壁扩张。成熟细胞壁扩张性的丧失是由于细胞壁硬化作用而对扩张性蛋白的作用不敏感造成的,细胞壁成熟过程中很多不同的连接会同时发生,当细胞壁基质多聚体分子之间的连接增加到一定的程度,细胞壁的伸长就会被完全抑制。
- 赵庆新袁生
- 关键词：植物细胞壁伸长
- 番茄(Solanum lycopersicum)果胶酸裂解酶P56在大肠杆菌中的重组表达被引量：1
- 2007年
- 果胶酸裂解酶P56在番茄花粉管伸长过程中起着重要的作用,为了制备番茄P56蛋白的抗体,进行番茄花粉管萌发过程中P56蛋白的免疫组织化学研究,对P56基因在大肠杆菌系统的重组表达进行了研究。先采用Overlap-PCR的方法,从番茄基因组DNA中克隆了成熟P56蛋白的cDNA序列(LAT56),再构建重组表达质粒pET28a(+)-LAT56,转化大肠杆菌BL21-CodenPlus(DE3)-RIL,得到了重组表达工程菌pET-28a(+)-LAT56-BL21-Co-denPlus(DE3)-RIL。在0.5 mmol/L IPTG、15℃和180 r/min条件下,经过60 h的诱导培养,重组蛋白表达量为细胞总蛋白的30%左右,主要以包涵体形式存在,重组蛋白经Ni2+-nitrilotriacetate-agrose亲和柱层析,得到了SDS-PAGE显示为单一蛋白带的纯化蛋白。
- 赵庆新王鑫张宇玲袁生
- 关键词：番茄大肠杆菌
- 用Overlap-PCR法从Trichodermareesei QM9414基因组DNA中克隆并表达木聚糖酶Ⅲ被引量：10
- 2004年
- 禾本科植物木聚糖酶在其成熟过程中需在细胞进入程序性死亡后 ,经蛋白水解酶多次剪切方显活性 ,常规蛋白质克隆表达系统无法表达这类酶。通过GenBank搜索获得一与之同族、结构相似的来源于T .reeseiQM94 1 4(ATCC2 6 92 1 )突变种PC 3 7菌株的xynⅢ。但该酶在T .reeseiQM94 1 4中不表达 ,而在基因组中存在。通过overlap PCR法将 4个外显子分别克隆、测序 ,再连接测序 ,最终获得该基因的全长cDNA序列。将该基因连接到表达载体pETBlue 2上 ,并转化到TunerDE3表达菌株中 ,常规条件下可表达并有木聚糖酶活性显示。低温 (1 5℃ ) 6
- 陆长梅袁生赵庆新
- 关键词：木聚糖酶禾本科植物基因组DNA克隆
