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兔软骨细胞与骨髓基质细胞的平面共培养：两者培养比例筛选被引量：5: 2010年; 背景：骨髓基质细胞一定条件下可以分化为软骨细胞,但目前还缺少将软骨与骨髓基质细胞平面共培养的深入探讨。目的：拟明确骨髓基质细胞与软骨细胞共培养时比例的选择、细胞增殖活性、软骨特异性蛋白表达的规律,用于细胞移植的最佳时间和传代次数。方法：软骨细胞与骨髓基质细胞的分离培养,传代后分为5组：单纯软骨细胞组;共培养组,软骨细胞与骨髓基质细胞7：3,5：5,3：7组;以及单纯骨髓基质细胞组。传代至第4代（G4）,倒置相差显微镜观察各组细胞在不同传代时期的细胞形态,MTT实验检测细胞增殖活性,甲苯胺蓝与阿利新蓝染色,细胞免疫化学法检测Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：共培养各组在各个时期细胞表型正常。G1-G3代细胞增殖活跃,G4代细胞增殖能力下降。共培养各组甲苯胺蓝与阿利新蓝染色以及Ⅱ型胶原表达在G2和G3代均较高。综合各指标认为,以软骨细胞与骨髓基质细胞的比例为5：5,3：7组为最佳。软骨细胞与骨髓基质细胞平面共培养,保持了软骨细胞的形态和蛋白表达特性,如进行细胞移植,选取软骨细胞与骨髓基质细胞5：5或3：7的比例为最佳。; 孙磊綦惠陈磊陈海燕江健陶剑锋杰永生高新生Peter I.Lelkes; 关键词：软骨细胞骨髓基质细胞共培养蛋白聚糖

脂肪干细胞复合真皮脱细胞基质修复兔关节软骨缺损的实验研究被引量：7: 2017年; 目的探讨脂肪间充质干细胞(ADSCs)复合小牛真皮脱细胞基质(ADM)参与修复兔膝关节软骨缺损的可行性。方法取自体新西兰兔的脂肪组织,采用酶消化分离培养ADSCs并传代,倒置相差显微镜观察细胞形态,FACS检测细胞表面特异性表达以鉴定细胞,行成脂和成骨诱导鉴定。小牛真皮通过脱细胞、交联和冻干制备小牛ADM,ADSCs达到一定数量后接种于ADM得到细胞支架复合物。24只新西兰大白兔随机分A、B、C共三组,A组关节软骨缺损处外科缝合细胞支架复合物,B组软骨缺损处外科缝合ADM,C组软骨缺损不做任何处理。分别于术后第12周处死动物,修复处行大体、组织学检测。结果成功分离鉴定新西兰兔的脂肪干细胞。经重塑后真皮脱细胞基质支架材料表面光滑、孔隙均匀。ADSCs与ADM复合后,缺损处类软骨组织填充,修复区表面光滑;Ⅱ型胶原免疫组化显示,复合支架已被吸收,再生的软骨是阳性。结论新型小牛ADM支架材料与ADSCs生物相容性好,ADSCs与ADM复合向软骨诱导后可良好地修复关节软骨缺损,具有替代正常软骨的潜力。; 舒雄郑蕊杰永生陈磊靳少锋綦惠孙磊; 关键词：脂肪干细胞关节软骨

脱细胞真皮基质制备及其生物相容性研究被引量：9: 2014年; 目的制备脱细胞真皮基质,检测其细胞及组织相容性,探讨其作为软骨组织工程支架材料的可行性。方法取新生小牛背部真皮组织,以0.5%SDS溶液水平振荡脱细胞,0.5%胰蛋白酶行胶原纤维结构重塑,甲醛浸泡进行交联,0.5%硫酸软骨素溶液中超声振荡进行表面修饰,制备脱细胞真皮基质支架材料。乙醇排除法检测结构重塑前后材料孔隙率变化;MTT法检测材料细胞毒性;将材料植入成年SD大鼠背部皮下,评价组织相容性。采用以3∶7比例共培养的第2代新西兰大白兔软骨细胞与骨髓基质细胞作为种子细胞,种植于脱细胞真皮基质支架材料(实验组),48 h后扫描电镜观察细胞黏附情况;RT-PCR和Western blot检测接种于支架的种子细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达,并与单纯培养的种子细胞(对照组)进行比较。结果经0.5%胰蛋白酶溶液结构重塑后的脱细胞真皮基质支架材料表面光滑、孔隙均匀;孔隙率达85.4%±2.8%,显著高于重塑前的支架(72.8%±5.8%)(t=—4.384,P=0.005);细胞毒性检测为1级,合格;埋植于大鼠背部皮下后,随时间延长,组织炎性细胞数呈减少趋势(P<0.05)。种子细胞接种后,扫描电镜示大量细胞贴附于支架上,细胞形态饱满,可见表面微绒毛和分泌现象。RT-PCR与Western blot检测结果示,实验组和对照组Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达量比较,差异均无统计学意义(t=1.265,P=0.235;t=0.935,P=0.372)。结论经脱细胞-结构重塑-交联-表面修饰制备的脱细胞真皮基质结构良好,种子细胞能大量黏附于支架材料上,细胞Ⅱ型胶原表达水平无明显改变,有望作为软骨组织工程支架材料。; 綦惠杰永生陈磊江建高新生孙磊; 关键词：软骨组织工程脱细胞真皮基质

脱钙骨基质与生物蛋白胶复合载体修复兔关节软骨缺损被引量：3: 2010年; 背景:应用组织工程学方法修复软骨组织缺损,需要有合适的载体,在发挥承载作用的同时对软骨细胞起到良好的固定作用。目的:观察利用脱钙骨基质与生物蛋白胶的复合载体修复实验性兔关节软骨缺损的可行性及有效性。方法:制备脱钙骨基质与生物蛋白胶的复合载体。建立兔关节软骨缺损模型,编号后,将42只新西兰大白兔随机分为3组:载体复合细胞组(n=15):兔膝关节软骨缺损区植入含有软骨细胞的脱钙骨基质与生物蛋白胶的复合载体;单纯载体组(n=15):植入不含细胞的复合载体;空白对照组(n=12):不进行任何植入处理。依照分组,分别于术后4,8,12周取材,进行大体、组织学、甲苯胺蓝染色观察,并做Wakitani评分,观察各组动物关节缺损修复效果。结果与结论:载体复合细胞组12周时可以修复膝关节软骨的缺损,并且以透明软骨组织为主,修复效果明显强于单纯载体组与空白对照组;Wakitani评分在各个时间均优于其他两组(P<0.05)。提示脱钙骨基质与生物蛋白胶的复合载体负载软骨细胞可以作为软骨组织工程支架材料,能够用于再生修复软骨的缺损。; 綦惠孙磊陈磊陶剑锋江健; 关键词：脱钙骨基质生物蛋白胶软骨细胞

用复合表面活性剂制备更安全的异种骨移植材料(英文)被引量：5: 2010年; 背景:表面活性剂脱细胞的效果和骨移植材料的生物安全性与表面活性剂的选择有较大关系。因此,实验采用新型的复合表面活性剂制备脱细胞骨移植材料。目的:应用新型表面活性剂处理生物源性骨组织,并进行脱细胞效果及生物安全性评价,以期得到一种更安全、可靠的骨植入材料。方法:2种阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠和脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠以及蒸馏水以质量比13∶7∶80的比例配制复合表面活性剂。以新鲜的牛松质骨为原料,复合表面活性剂脱脂脱细胞两步法工艺,制备新型生物源性骨植入材料。结果与结论:复合表面活性剂生物源性骨颜色呈乳白色,未见杂质,组织学及超微结构观察可见骨陷窝内细胞结构消失,骨小管空虚,胶原纤维排列整齐。生物安全性实验表明:按GB/T16886.11-1997标准急性全身毒性试验合格,溶血试验<5%,细胞毒性试验0级。复合表面活性剂生物源性骨组织中表面活性剂的残留量低于0.1g/L。骨长期植入实验表明:植入材料与宿主骨融合良好,24周后被机体完全吸收。说明复合表面活性剂处理的生物源性骨移植材料具有良好的生物相容性和生物降解性,是一种安全、可靠的骨植入材料。; 陈磊孙磊陶剑峰江健高新生杰永生田伟; 关键词：脱细胞表面活性剂骨移植骨移植材料

以海藻酸盐及异种骨复合技术制备组织工程化骨及体内成骨(英文)被引量：4: 2010年; 背景:海藻酸有相对温和的凝胶条件与良好的生物相容性,已广泛应用于生物组织工程。目的:采用海藻酸钠凝胶复合异种骨的方法,构建骨组织工程载体,观察载体中细胞的生物性能及体内成骨能力。方法:取2只2周龄新西兰兔的骨髓,以1×10-8mol/L重组人骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞。取诱导后第2代骨髓间充质干细胞接种于1%海藻酸钠凝胶中,培养4d苏木精-伊红染色观察凝胶中细胞形态。将第2代骨髓间充质干细胞分为单纯DMEM凝胶组和含1%海藻酸钠的DMEM凝胶组,分别培养7d后行骨形态发生蛋白2免疫组织化学染色观察。取24只裸鼠,随机分为2组,于两侧股部肌袋中分别植入骨髓间充质干细胞/海藻酸钠凝胶/牛松质骨复合体作为实验组,骨髓间充质干细胞/牛松质骨复合体作为对照组。术后2,4周后组织学观察复合体成骨情况,图像分析系统分析各组成骨或软骨的面积百分比。结果与结论:海藻酸钠凝胶中骨髓间充质干细胞形态饱满,细胞悬浮于凝胶中,可见细胞分裂和核分裂相。单纯DMEM凝胶组和含1%海藻酸钠的DMEM凝胶组免疫组织化学观察,细胞分裂增殖正常,伸出多种形态的突起,胞核大,核仁清晰。单纯DMEM凝胶组和含1%海藻酸钠的DMEM凝胶组的骨形态发生蛋白2表达阳性率差异无显著性意义(P>0.05)。扫描电镜观察海藻酸钠凝胶均匀地复合于牛松质骨微孔中,不同平面均有细胞生长。动物实验显示术后2,4周实验组和对照组的成骨或软骨的面积百分比差异有显著性意义(P<0.05)。提示以海藻酸钠凝胶/牛松质骨构建骨组织工程载体,合乎组织工程载体的超结构原理,能最大限度地承载细胞,生物性能好,对骨髓间充质干细胞增殖和成骨表型及相关的生物性能无不良影响,在体内成骨效率较高。; 孙磊孟国林陈磊陶剑锋江健张柏青窦榆生徐建强刘丹平胡蕴玉张仲文; 关键词：组织工程骨异种骨

离心重力诱导脂肪间充质干细胞向软骨样细胞分化被引量：2: 2018年; 目的探讨离心重力对人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)向软骨样细胞分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法通过加载不同离心力(0、500、1000、2000、2500、3000×g)和持续时间(0、15、30、45、60 min)刺激脂肪干细胞分化为软骨样细胞,并利用荧光定量PCR和Western blot检测Sox 9基因的上调表达来筛选条件,将培养的P3代h ADSCs分3组,对照组(不干预处理)、离心重力组和TGF-β3组(加入TGF-β3成软骨诱导剂),持续培养21 d后,通过阿利辛蓝和苏木精-伊红染色进行软骨分化鉴定,DMMB法测定胞外基质中GAG含量,荧光定量PCR测定Ⅱ型胶原基因表达,Western blot进一步检测对照组和离心重力组中Sox 9、β-catenin、GSK3β和p-GSK3β蛋白的表达。结果加载最适的离心重力(2500×g,30 min)刺激h ADSCs后,培养24 h,Sox 9的m RNA和蛋白表达显著上调。阿利辛蓝和苏木精-伊红染色显示,离心重力组和TGF-β3组中软骨表达呈阳性。GAG实验结果显示,TGF-β3组促GAG分泌的能力优于离心重力组(P<0.05),荧光定量PCR结果表明TGF-β3组其Ⅱ型胶原mRNA表达的能力高于离心重力组(P<0.05),Western blot结果显示,相比对照组,离心重力组中β-catenin和p-GSK3β的蛋白表达水平降低,而GSK3β和Sox 9蛋白表达升高。结论离心重力和TGF-β3诱导脂肪干细胞成软骨分化中的表达具有相似的能力,离心重力对h ADSCs诱导成软骨作用与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。; 舒雄杰永生郑蕊陈磊靳少锋綦惠孙磊; 关键词：人脂肪干细胞超重力 SOX 软骨分化

海藻酸钠凝胶复合异种骨构建组织工程骨及体内成骨被引量：12: 2008年; 目的采用海藻酸钠凝胶(sodium alginate,A)复合异种骨的方法,构建骨组织工程载体,观察载体中细胞的生物性能及体内成骨能力,为构建效率更高的骨组织工程载体提供实验依据。方法取2只2周龄新西兰兔的骨髓,以rhBMP-2(1×10-8 mol/L)诱导培养BMSCs。取诱导后第2代BMSCs接种于1%(V/W)A中,培养4 d HE染色观察凝胶中细胞形态。将第2代BMSCs分为单纯DMEM凝胶组和含1%A的DMEM凝胶组,培养7 d后行BMP-2免疫组织化学染色观察。第2代BMSCs与2%(V/W)A的DMEM凝胶混合,负压下复合去抗原牛松质骨(xenograft bone,X),4 d后扫描电镜观察细胞生长情况。取24只裸鼠,随机分为2组(n=12),于两侧股部肌袋中分别植入BMSCs-A-X复合体作为实验组,BMSCs-X复合体作为对照组。于术后2、4周后组织学观察复合体成骨情况,图像分析系统分析各组成骨或软骨的面积百分比。结果HE染色观察,培养4 d A中BMSCs细胞形态饱满,细胞悬浮于凝胶中,可见细胞分裂和核分裂相。单纯DMEM凝胶组和含1%A的DMEM凝胶组免疫组织化学观察,细胞分裂增殖正常,伸出多种形态的突起,胞核大,核仁清晰。单纯DMEM凝胶组BMP-2表达阳性率为44.10%±3.02%;含1%A的DMEM凝胶组为42.40%±4.83%,差异无统计学意义(P>0.05)。扫描电镜观察:A均匀复合于X微孔中,不同平面均有细胞生长。植入裸鼠体内2周后,实验组及对照组中均有软骨和骨组织形成;实验组软骨面积百分比为7.31%±0.32%,骨为5.26%±0.24%;对照组软骨为2.31%±0.21%,骨为2.16%±0.22%;两组差异有统计学意义(P<0.05)。术后4周,两组软骨和新生骨小梁及骨髓组织较2周时增多;实验组软骨面积百分比为9.31%±0.31%,骨为7.26%±0.26%;对照组软骨为3.31%±0.26%,骨为2.26%±0.28%;两组差异有统计学意义(P<0.05)。术后2、4周同组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论以A-X构建骨组织工程载体,符合组织工程载体的超结构原理,最大限度地承载细�; 孙磊张柏青陈磊陶剑锋江健孟国林窦榆生徐建强刘丹平胡蕴玉; 关键词：组织工程骨异种骨体内成骨

两种交联剂制备软骨细胞移植支架的比较被引量：4: 2013年; 目的试用两种交联剂对小牛真皮基质来源的支架材料进行交联,比较支架的细胞毒性、结构、生物相容性和细胞贴附的差异,为在体动物试验提供实验依据。方法将脱细胞真皮基质分为两组,分别浸入0.05%戊二醛溶液和0.2%水溶性交联剂进行交联,MTT法检测细胞毒性和溶血率。将交联后的支架分别植入大鼠皮下,评价生物相容性。以排液法粗测孔隙率,并在电镜下观察支架的结构和孔隙大小。培养间充质干细胞并贴附于两种方法处理的材料表面,电镜下观察贴附情况。结果以戊二醛溶液和水溶性交联剂两种方法处理的支架细胞毒性检测均合格,溶血率分别为4.61%与2.97%,均符合国家标准。经戊二醛交联的支架生物相容性差,炎症反应始终存在,水溶性交联剂处理的真皮基质组织相容性较好,仅有轻微的炎症反应。水溶性交联剂制备的支架材料孔隙率为84.3%±5.0%,戊二醛制备的支架材料孔隙率为79.7%±10.8%,差异不具有统计学意义(P>0.05)。戊二醛交联的支架细胞贴附差,而水溶性交联剂制备的支架细胞贴附良好。结论应用水溶性交联剂处理的支架细胞毒性和溶血率检测均合格,具有良好的生物相容性、孔隙率和细胞贴附性,该法可以作为后期制备软骨细胞移植支架的交联方法。; 綦惠杰永生陈磊陶建峰江建孙磊; 关键词：细胞毒性

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北京市科技新星计划(H013610310113)

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