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新型狂犬病病毒中和抗体检测方法的建立: 2013年; 目的建立一种安全、快速、经济的新型狂犬病病毒中和抗体的检测方法。方法在狂犬病病毒弱毒株HEP-Flury基因组Ψ区插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein eGFP)基因,利用反向遗传技术,拯救重组病毒rHEP-eGFP,分别采用荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定及电镜观察等方法对rHEP-eGFP病毒进行鉴定;分别绘制rHEP-eGFP和亲本毒株HEP-Flury的生长动力学曲线;将rHEP-eGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,测定各代次rHEP-eGFP的滴度,荧光显微镜下观察eGFP的表达;采用TCID50法检测狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11和rHEP-eGFP的毒力;以rHEP-eGFP病毒为抗原,建立新型荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibodyvirus neutralization,FAVN)-eGFP,对25份犬血清的抗体效价进行测定,并与标准FAVN检测结果进行比较。结果经荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定和电镜观察表明,成功拯救出rHEP-eGFP病毒;重组病毒rHEP-eGFP与亲本病毒HEP-Flury的生长特性相似;rHEP-eGFP连续传代9次,均能稳定表达eGFP;CVS-11的毒力为108TCID50/ml,rHEP-eGFP的毒力为107.3TCID50/ml;FAVN-eGFP与FAVN测定25份犬血清抗体效价的结果具有良好的一致性。结论建立的新型狂犬病病毒中和抗体检测方法(FAVN-eGFP)准确度高,特异性好。; 薛向红郑学星盖微微李岭马金柱冯娜王铁成黄耕赵永坤杨松涛夏咸柱; 关键词：狂犬病病毒绿色荧光蛋白

H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立被引量：3: 2011年; 利用RT-PCR技术扩增猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07(H1N2)的8个基因片段,分别克隆至双向转录表达载体PBD上,构建出8个能在哺乳细胞中复制和表达的质粒。将8个质粒共转染293T细胞,收取转染48 h时的细胞上清并接种9～11日龄SPF鸡胚,成功拯救出有血凝活性的病毒。经序列测定,确定拯救病毒的8个基因片段均来自猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07(H1N2)基因组。H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;同时,为H1N2亚型猪流感新型疫苗的研制开辟了新的途径。; 黄梦于海周艳君李泽君马继红杨馥如童光志; 关键词：猪流感反向遗传操作技术

狂犬病病毒CVS-11株全序列测定及其感染性克隆的构建被引量：1: 2013年; 【目的】测定狂犬病病毒标准攻击毒CVS-11株全基因组序列,构建CVS-11株全长cDNA感染性克隆。【方法】RT-PCR扩增CVS-11株全基因组得到有重叠的12个片段,分别克隆至平端载体pEASY-Blunt,测定CVS-11株全基因组核苷酸序列。用软件DNAMAN分析CVS-11全序列单一性酶切位点,设计引物,分4段扩增CVS-11全基因组,扩增产物经多步酶切、连接逐步插入至真核表达载体pcDNA3.1,获得全长质粒pcDNA3.1-CVS-11。pcDNA3.1-CVS-11与其辅助质粒pcDNA3.1-N、P、L、G共转染NA细胞,经免疫荧光染色、RT-PCR鉴定,拯救得到重组病毒rCVS-11。【结果】CVS-11全基因组序列由11 927个核苷酸组成,编码5个结构蛋白,结构基因排列同已知的其他狂犬病病毒一致。成功构建了CVS-11全长cDNA重组质粒pcDNA3.1-CVS-11和其辅助质粒pcDNA3.1-N、P、L和G。经共转染,成功拯救了重组病毒rCVS-11。【结论】CVS-11株感染性克隆的构建为从分子水平上进一步研究狂犬病病毒奠定了基础。; 薛向红郑学星盖微微梁红茹马金柱李岭王铁成冯娜黄耕赵永坤杨松涛夏咸柱; 关键词：狂犬病病毒全序列测定

东方马脑炎E2蛋白原核表达及免疫活性初步研究被引量：1: 2013年; 为构建东方马脑炎病毒E2基因原核表达载体,完成E2蛋白表达及其免疫活性研究。利用PCR方法扩增E2编码全基因,大小为1 260 bp,将酶切后目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)上,构建成重组质粒pET30a(+)-EEEV-E2,采用酶切和测序分析方法鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,诱导E2蛋白表达,并用SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析和鉴定目的蛋白;最后,用纯化的E2蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠随机分成4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组、E2蛋白免疫组和E2蛋白+弗氏佐剂免疫组,每组小鼠免疫2次,两次免疫间隔时间为14天,免疫剂量均为100μL/只;小鼠初次免疫后第10天,用细胞因子ELISA试剂盒检测血清中IL-6、IL-12与TNF-α的浓度,加强免疫后第14天,用EEEV的假病毒检测血清中E2蛋白抗体的中和作用。结果表明完成了E2基因的原核表达载体pET30a(+)-E2构建和成功表达了带有His标签的E2融合蛋白,蛋白以包涵体形式存在,大小为53.0 kDa;免疫小鼠血清中产生了高水平的IL-6、IL-12与TNF-α和具有较强中和作用的E2蛋白抗体。研究结果为今后E2蛋白作为基因工程亚单位疫苗的研究提供了重要参考。; 马金柱王化磊郑学星吴红霞薛向红王铁成杨松涛夏咸柱; 关键词：东方马脑炎病毒原核表达 E2蛋白免疫活性

西方马脑炎病毒E2基因的克隆与原核表达被引量：1: 2013年; 目的克隆并原核表达西方马脑炎病毒(Western equine encephalomyelitis virus,WEEV)E2基因。方法采用PCR法从重组质粒pVL1393-C-E中扩增E2基因,插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-E2,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-30a(+)-E2经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为52 900,诱导6 h目的蛋白的表达量较高,约占菌体总蛋白的23.5%,重组蛋白主要以包涵体形式存在,可与鼠源His单克隆抗体特异性结合。结论克隆并原核表达了WEEV E2基因,为E2蛋白免疫原性及WEEV亚单位疫苗的研究奠定了基础。; 马金柱王化磊郑学星赵永坤高玉伟王铁成黄耕杨松涛夏咸柱; 关键词：E2基因克隆原核细胞基因表达

表达扎伊尔型埃博拉病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建被引量：3: 2013年; 埃博拉病毒(EBO V)能够引起一种人畜共患急性出血性传染病,即埃博拉出血热。研制安全、有效的抗病毒疫苗具有重要意义。本研究利用水泡性口炎病毒(V SV)印第安纳株反向遗传操作系统,构建并拯救得到表达扎伊尔型埃博拉病毒(ZEBO V)囊膜糖蛋白G P的重组V SV(rV SV-ZEBO V-G P),通过w estern blot和免疫荧光试验证明在重组病毒中ZEBO V G P蛋白获得正确表达;动物试验显示重组病毒对小鼠高度安全;中和试验结果表明重组病毒能诱导小鼠产生针对ZEBO V囊膜糖蛋白G P嵌合V SV假病毒粒的特异性中和抗体。本研究表明rV SV-ZEBO V-G P作为防控ZEBO V的储备性疫苗具有潜在的应用价值。; 宋坤王喜军温志远葛金英冯娜胡旭乐陈伟业高玉伟夏咸柱步志高; 关键词：囊膜糖蛋白

狂犬病病毒HEP-Flury-mEG株的拯救与鉴定被引量：2: 2012年; 目的拯救狂犬病毒HEP-Flury-mEG株,为疫苗制备奠定基础。方法将ERA株G蛋白333位毒力位点修饰为谷氨酸后替换至HEP-Flury株基因组。重组感染性克隆质粒和4个辅助质粒,共转染BHK-21细胞,拯救重组病毒。结果 IFA鉴定成功拯救出了HEP-Flury-mEG株狂犬病病毒。重组病毒G基因经XholⅠ酶切,片段大小为1 071bp和520bp,与预期结果相符。重组病毒在BHK-21细胞中传代4次,滴度维持在1×107.5 FFU/ml。重组病毒经常规负染后在电镜下为弹状粒子,长度和直径与亲本株一致。结论获得了重组狂犬病毒HEP-Flury-mEG株。该病毒滴度高,形态完整,传代稳定,为进一步研究狂犬病毒病毒的生物学特性和新型基因工程疫苗奠定了基础。; 郑学星杨松涛王化磊薛向红盖微微赵永坤郭霄峰夏咸柱; 关键词：狂犬病病毒

西方马脑炎核酸疫苗表达载体构建及免疫原性研究: 2013年; 为构建西方马脑炎病毒(western equine encephalomyelitis virus,WEEV)结构基因C-E3-E2-6k-E1重组真核表达载体,并研究其作为核酸疫苗的免疫原性。采用PCR方法扩增目的基因,酶切之后连接到pcDNA3.1上构建真核表达载体pcDNA3.1-C-E,用酶切和测序分析方法鉴定正确后,重组质粒被转染到293T细胞,经电镜检测和间接免疫荧光方法证明基因可以表达后,用该重组质粒免疫小鼠,免疫后检测实验组小鼠外周血中CD4+T细胞/CD8+T细胞比例和血清中细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ浓度,以上实验组各项免疫指标与对照组相比差异均显著(P<0.05);ELISA方法检测实验组小鼠血清中WEEV的IgG抗体效价是1∶16。研究结果表明重组质粒pcDNA3.1-C-E可在细胞中获得瞬时表达,并且重组质粒作为核酸疫苗能够刺激小鼠产生免疫反应,具有较强免疫原性,为今后WEEV核酸疫苗研制奠定了良好基础。; 马金柱王化磊郑学星吴红霞赵永坤王铁成杨松涛夏咸柱; 关键词：核酸疫苗免疫原性

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“十一五”国家科技支撑计划(2010BAD04B03)

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