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大菱鲆血清免疫球蛋白IgM的纯化及应用研究被引量：8: 2008年; 用硫酸铵分级盐析法纯化大菱鲆血清免疫球蛋白IgM,所得产物用Sepharose-4B和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析进一步纯化,以纯化的大菱鲆IgM免疫新西兰大白兔,获得兔抗大菱鲆IgM抗血清。SDS-PAGE电泳显示大菱鲆IgM重链为76 kD,轻链为27 kD;纯化的大菱鲆IgM重链与特异性抗血清具有较好的反应,而轻链与抗血清反应不明显;以制备的兔抗大菱鲆IgM抗血清为二抗建立了大菱鲆血清特异性抗体的间接ELISA检测方法,用该方法检测了鳗弧菌灭活疫苗免疫后大菱鲆产生特异性抗的变化规律,大菱鲆在免疫后第1周就产生了特异性抗体,在3周时达到峰值,该特异性抗体可维持13周以上。; 魏鉴腾陈吉祥王淑娴张晓华王印庚; 关键词：大菱鲆 IGM 纯化抗血清 ELISA

鳗弧菌rpoS基因克隆及在大肠杆菌中的表达被引量：1: 2009年; 鳗弧菌是海水鱼类弧菌病的重要病原,弧菌病的发生及流行与该菌在环境中的生存密切相关。RpoS因子是细菌RNA聚合酶的主要组成部分,能够调控细胞对不良环境的抵抗和适应能力。本文从鳗弧菌W-1基因组DNA扩增1 002 bp的特异性片段,序列分析表明含有完整的rpoS基因阅读框,编码333个氨基酸残基的蛋白质。与其他鳗弧菌菌株的rpoS基因序列相似性为100%,与霍乱弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、溶藻胶弧菌rpoS基因的序列相似性分别为78%,77%,77%,76%,75%,与大肠杆菌的序列相似性为71%。将该基因克隆于表达质粒pET-24d(+),在大肠杆菌中表达,用镍亲和层析柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化的蛋白为单一条带,蛋白分子量约42 kDa,与理论分析值相近。研究结果为探索鳗弧菌对自然环境的适应及疾病发生机制提供了依据。; 马莉陈吉祥刘瑞魏鉴腾姜荧安; 关键词：鳗弧菌克隆纯化

鳗弧菌W-1金属蛋白酶基因真核表达载体的构建及其在动物细胞中的表达: 2010年; 采用基因克隆方法,以带有突变的鳗弧菌W-1金属蛋白酶基因的原核表达质粒pET24d(+)/m-empA7为模板,通过PCR扩增得到m-empA7基因,将其插入pCDNA3.1(+)构建重组真核表达质粒pCDNA3.1(+)/m-empA7;然后用磷酸钙法将其转染入动物细胞CHO和HEK293T中并进行瞬时表达,分别以RT-PCR和Western-blot检测重组质粒的基因转录和蛋白表达情况。结果表明,成功将突变的鳗弧菌W-1金属蛋白酶基因转染至真核细胞中,并能够在动物细胞中正确地转录和表达,为鳗弧菌基因工程疫苗的研制奠定了基础。; 杨慧陈吉祥张晓华李筠薛小平; 关键词：金属蛋白酶真核表达基因疫苗

山东威海-日照近岸海域浮游细菌的分布特征被引量：2: 2010年; 于2006年8月～2007年10月，分春夏秋冬四个航次对山东威海一日照近岸海域进行了现场调查，研究了该海区浮游细菌丰度、生物量及可培养异养细菌生物量的分布特征，探讨了它们与温度、溶解氧、总有机碳、总N、总P和活性磷酸盐之间的关系。结果表明：浮游细菌生物量具有一定的时间、空间分布特征，冬季浮游细菌生物量明显低于其他三个季节，近岸生物量高于远岸区域；浮游细菌丰度及生物量与温度、溶解氧、总有机碳呈非常显著相关关系（P〈0．01）；夏冬季节可培养异养细菌数与总N、总P及PO4-P均呈现显著相关关系，表明以上三种环境生态因子可能是该海域可培养异养细菌生长的限制因子。; 张喆肖慧蔡恒江于庆云滕海波唐学玺; 关键词：环境因子

哈维氏弧菌铁超氧化物歧化酶基因表达及免疫作用研究被引量：4: 2012年; 哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是鱼虾等海水动物的重要病原菌。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)通过催化超氧阴离子自由基(O2)形成O2和H2O2,以保持细胞自由基产生和清除之间的平衡,在病原菌适应环境及细菌致病性方面发挥重要作用。用PCR从哈维氏弧菌基因组扩增得到600 bp的目的片段,序列分析表明与弧菌Fe-SOD的序列相似性为91%—99%。将目的基因片段克隆到原核表达载体进行表达。SDS-PAGE电泳分析显示纯化的蛋白为单一条带,分子量为27 kD。具有典型的Fe-SOD吸收光谱,对氯仿-乙醇和H2O2敏感,表明纯化的蛋白属于Fe-SOD。用邻苯三酚自氧化法测得酶的最适pH 7,最适温度20℃。该酶在pH6—8的范围内稳定,当温度超过40℃时酶的活力迅速丧失。纯化的重组蛋白免疫大菱鲆,4周后用致病性哈维氏弧菌进行人工感染试验,对大菱鲆的免疫保护率为80.00%。Western blot可以检测到免疫大菱鲆的血清中的特异抗体。; 辛瑞晓易飞张蕊徐涛玄璞刘瑞贾俊涛陈吉祥; 关键词：哈维氏弧菌超氧化物歧化酶基因免疫原性

哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用被引量：10: 2012年; 从致病性哈维氏弧菌Vibrio harveyi SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶(trxR)基因的1 133bp目的片段,连接至载体pMD19-T Simple。测序结果表明,目的片段含有960 bp trxR基因阅读框,编码为319个氨基酸残基的蛋白质。Blast分析结果显示,硫氧还蛋白还原酶蛋白氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列的相似性分别为99%、98%、96%、94%、92%。构建表达质粒pET-28a(+)/TrxR后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示,重组蛋白的相对分子质量为34 000。用Ni琼脂糖亲和层析柱分离得到纯化的重组蛋白,将该蛋白以50μg/尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆Scophthalmus maximus,用ELISA法检测免疫1～4周内鱼血清中特异性抗体的效价。结果表明,特异性抗体效价持续升高,第2周则达到1∶128。免疫4周后用哈维氏弧菌SF1对大菱鲆进行人工感染,对照组鱼的死亡率为100%,免疫组鱼的死亡率为25%,相对免疫保护力为75%。试验表明,哈维氏弧菌TrxR蛋白具有较好的免疫原性,可作为潜在的亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。; 陶然刘瑞王晴陈吉祥; 关键词：哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶大菱鲆免疫原性

副溶血弧菌一种糖蛋白酶(复苏促进因子)在大肠杆菌中的表达及性质: 2012年; 用PCR方法从副溶血弧菌8621.4基因组中扩增出1种细胞复苏促进因子家族的糖蛋白酶(Glycoprotease,Gcp)基因,核酸序列分析表明其含有完整的gcp基因开放阅读框,编码233个氨基酸组成的蛋白质。核酸序列与副溶血弧菌糖蛋白酶家族基因的序列相似性为100%。其氨基酸序列与哈维氏弧菌HY01、弧菌Ex25、溶珊瑚弧菌、拟态弧菌和杀鲑弧菌LFI1238等糖蛋白酶的序列相似性为67%～92%。将该基因克隆到表达载体pET28a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用Ni琼脂糖亲和柱层析纯化的蛋白为单一条带,利用纯化的Gcp免疫新西兰大白兔制备特异性抗体,Western-Blotting分析发现正常生长及活的非可培养状态(VBNC)诱导过程中的副溶血弧菌细胞内表达的Gcp蛋白为1条带,分子量约为27kDa,而在VBNC状态的菌体中检测到2条蛋白带。研究结果为进一步探索海洋弧菌活VBNC的形成和复苏机制奠定基础。; 赵明君贾俊涛陈吉祥; 关键词：副溶血弧菌

青岛、威海水域夏冬季表层沉积物细菌多样性的初步研究被引量：14: 2009年; 以青岛、威海水域夏冬两季表层沉积物中的基因组DNA为模板,扩增沉积物样品中细菌的16S rDNA片段,并构建其相应文库。进行16S rDNA序列分析,并与数据库中的序列进行比对。分析结果表明:2个站位沉积物样品细菌分别属于11个主要细菌门类,包括:变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Plancomycene)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、硝化螺菌门(Nitrospirae)、疣微菌门(Verrucomicrobial)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿屈挠菌门(Chlo-roflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、高G+C含量革兰氏阳性菌放线菌门(Actinobacteria)和低G+C含量革兰氏阳性菌梭菌门(Clostridiales)。其中变形菌门是主要类群,且γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)占优势。与QD2站位相比,QD1站位沉积物细菌多样性随季节变化不大。; 肖慧张艳张喆朱琳游偲唐学玺; 关键词：沉积物细菌多样性

春秋季山东南部近岸浮游细菌生态分布被引量：4: 2009年; 分别于2007年4月(春季)和10月(秋季),对山东南部近岸海域进行了现场调查,研究了该海区浮游细菌丰度、生物量分布特征,探讨了它们与温度、溶解氧(DO)、总氮(N)、总磷(P)、硝酸盐(NO3-)、铵盐(NH2+)及活性磷酸盐(PO4-P)的相关性。结果表明:浮游细菌生物量具有一定的时间、空间分布特征,春季浮游细菌丰度及生物量要高于秋季,2个季节近岸细菌数量高于远岸区域;浮游细菌丰度及生物量与温度、DO、总P、NO3-、NH2+及PO4-P均呈显著相关关系(P<0.01),表明上述因子可能是该海域浮游细菌数量分布的主要限制因子。; 肖慧张喆张艳于庆云唐学玺; 关键词：环境因子

鳗弧菌W-1对花鲈鱼苗致病性的初步研究被引量：5: 2008年; 为研制和生产鲈鱼苗疫苗提供依据,采用人工感染试验方法测试了花鲈(Lateolabrax japonicus)烂尾、出血病病原菌W-1菌株(鳗弧菌Vibrio anguillarum)对花鲈苗的半致死浓度(LD50)及不同保存条件下的W-1菌株的致病力。试验结果表明:W-1菌浴感染花鲈苗的半致死浓度为2.5×107.5个/mL,针刺后菌浴感染花鲈苗的半致死浓度为2.5×107个/mL;该病原菌为一条件致病菌,创伤感染是主要的致病途径;常温多次传代、15℃、-20℃和-80℃等不同保存条件下W-1菌株的致病力均很强,但常温多次传代保存的菌株致病力比其他3种方法保存的菌株致病力稍差一些。; 肖慧唐学玺陈吉祥张培玉蔡恒江

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国家高技术研究发展计划(2007AA09Z416)

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