国家自然科学基金(30671189)
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
- 相关作者：鲁茁壮洪涛屈建国王敏韩炳娟更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心中国医学科学院北京协和医学院山东省医学科学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 转染E1B55K基因提高Hep2细胞包装肠腺病毒Ad41的能力
- 2007年
- 人F组腺病毒Ad40、Ad41难以在体外培养的细胞中传代,被称为难养腺病毒(Fastidious adenovirus)。本研究观察了在Hep2细胞表达Ad41 E1B55K基因对Ad41复制的促进作用。从Ad41阳性粪便标本中用PCR的方法获得E1B55K基因,构建真核表达载体,转染Hep2细胞,筛选单克隆,用RT-PCR检测了E1B55K基因的表达。用引起293细胞完全CPE比较产毒量的方法对所得细胞克隆进行初步筛选,获得一株产毒相对较强的细胞Hep2-E1B#4。与对照细胞Hep2、Hep2-DNA3相比,等量Ad41接种Hep2-E1B#4产生的细胞病变效应(CPE)程度明显加深。用免疫细胞化学的方法测定产毒的感染滴度,等量Ad41接种后,Hep2-E1B#4产生的子代腺病毒滴度大于对照的9倍;半定量PCR测得Hep2-E1B#4子代病毒基因组拷贝数约为对照细胞的4倍。结果说明转染E1B55K基因促进了Ad41在Hep2细胞的复制,获得的Hep2-E1B#4细胞株可用于Ad41的分离、培养和体外扩增。
- 韩炳娟郭丽屈建国王敏王健伟鲁茁壮洪涛
- 关键词：HEP2病毒复制
- 原核表达人41型腺病毒(Ad41)蛋白V及其抗血清的制备
- 2009年
- 【目的】人肠腺病毒Ad41被称为难养腺病毒,其难以培养的特性可能与次要核心蛋白V(Ad41proteinV,pV)表达不充分有关。本研究拟表达纯化Ad41pV抗原,免疫动物制备抗血清,为研究Ad41难养性机理打下基础。【方法】以野生型Ad41基因组DNA为模板,PCR扩增pV,克隆到原核表达载体pET30a(+),测序后,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,固化金属亲和层析(IMAC)方法纯化,免疫BALB/c小鼠制备抗血清,将获得的抗血清用于Western blot检测Ad41感染各细胞系后pV的表达。【结果】克隆得到包括完全编码区的pV基因,表达质粒转化BL21(DE3)菌株,使用1mmol/LIPTG37℃诱导4h,pV以包涵体形式表达,或使用0.5mmol/LIPTG25℃诱导8h获得可溶性表达。利用皮下多点注射包涵体的方法免疫小鼠,得到抗pV抗血清;使用纯化的可溶性pV作为抗原对抗血清进行了鉴定,表明该抗血清可用于Western blot检测。等量野生型Ad41感染293或293E12细胞(一株稳定表达Ad41E1B55K基因的293细胞)后,pV在293E12细胞的表达明显高于293细胞。【结论】成功克隆了Ad41pV基因,表达纯化了重组蛋白,获得了可用于Western blot检测的抗血清,为进一步研究Ad41难养性机理打下了基础。
- 董流昕邹小辉宋敬东屈建国鲁茁壮洪涛
- 关键词：PROTEINV抗血清
