国家科技重大专项(2011ZX09506-007)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 相关作者：王明蓉罗莉李坤代云见丛聪更多>>
- 相关机构：成都生物制品研究所有限责任公司成都学院(成都大学)四川抗菌素工业研究所更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 重组sTNFα-R1蛋白同义密码突变库的构建及筛选
- 2013年
- 目的:以重组肿瘤坏死因子-α受体1(sTNFα-R1)的基因序列为模板,构建同义密码突变库,在不改变原氨基酸序列的同时筛选获得目标蛋白产量提高的突变菌株。方法:分段设计并合成同义密码突变兼并引物,通过优化PCR反应条件,构建目的基因的完整同义密码突变库。突变库经双酶切插入到pET11(b)载体上,并电转至E.coli BL21(DE3)细胞中。阳性克隆经PCR鉴定后,细胞表达目标蛋白,应用SDS-PAGE等方法分析目标蛋白产量。结果:目的基因同义突变库的PCR扩增产物可见330bp的特征条带,突变库测序结果显示整个基因序列的第三位碱基发生预期的同义突变;完成了445株克隆筛选,针对其中产量高于对照组的45株克隆进行测序,获得42株基因序列不同但氨基酸序列未发生变化的克隆菌株,其同义密码突变阳性率高达93%;选择其中2株初筛产量较高的菌株进行放大验证,结果显示7#突变株的包涵体收率及目标蛋白相对百分含量明显高于对照株,其每升发酵液的目标蛋白总产量比对照株提高2.44倍,405#突变株比对照株提高1.44倍。结论:通过优化PCR反应条件成功构建了目标基因全序列的同义密码突变库,采用同义密码突变库技术途径,在不改变原氨基酸序列的前提下可以快速优化蛋白表达产量。
- 何静丛聪代云见李坤王明蓉
- 重组sTNFR1蛋白包涵体洗涤方法的研究被引量：3
- 2013年
- 目的:包涵体在变复性前通常需要用洗涤液多次重复洗涤以除去杂质,这种洗涤方式往往造成包涵体收率低或洗涤时间长或纯度不高,直接影响到重组蛋白产品最终的产量和质量。通过对sTNFR1包涵体的洗涤条件进行优化,以期指导该品种的工业化生产。方法:首先采用由脱氧胆酸钠和尿素组成的两因素五水平的析因设计,以洗涤后目的蛋白的含量为评价指标,进行方差分析,选出最优组合;通过对方差结果的分析提出不同于重复洗涤的分步洗涤方式,选出较优的分步洗涤方式;然后放大洗涤样品量,验证重复洗涤和分步洗涤的结果;另外,针对不同发酵批次和产量的样品,进一步验证比较重复洗涤和分步洗涤的效果。结果:重复洗涤的方差结果表明单独使用脱氧胆酸钠或尿素洗涤的产量优于两者的联合使用,但其纯度低于两者的联合使用,其中1mol/L尿素洗涤3次(W3组合)获得的目的产量最高;分步洗涤中2%脱氧胆酸钠洗涤第一次,2%脱氧胆酸钠+2mol/L尿素洗涤第二次的洗涤方式(FW6组合)既能有效提高目的蛋白纯度,又节约了时间,是较优的组合方式;同一发酵水平(约20%目的产量)不同规模样品(3g和50g)分别经过W3和FW6洗涤后,蛋白纯度提高到约26%和31%,且后者的目的收率高于前者,表明分步洗涤优于重复洗涤;针对不同发酵水平的样品(约10%和60%目的产量),分步洗涤的效果也优于重复洗涤,但对于低发酵水平的样品,分步洗涤对其纯度的提高更明显。结论:通过对该包涵体洗涤条件的摸索,找到一种较重复洗涤更有效的分步洗涤方法,既提高了目的纯度又节约了洗涤时间,为包涵体的洗涤提供了一种新的思路。
- 罗莉秦娇荣王明蓉
- 关键词：包涵体尿素
