国家自然科学基金(30371000)
- 作品数：11 被引量：84H指数：6
- 相关作者：林俊芳郭丽琼张秀春吴坤鑫林俊扬更多>>
- 相关机构：华南农业大学中国热带农业科学院莆田市农业科学研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金广东省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学轻工技术与工程更多>>
- 银耳芽孢完整细胞高效转化体系的建立被引量：13
- 2008年
- 银耳(Tremella fuciformis)属于高等担子菌,其担孢子芽殖产生酵母状分生孢子称为银耳芽孢.银耳芽孢单核,能像酵母那样快速生长且容易培养,具备优良外源基因表达宿主的特点.本研究以gpd-Gl启动子分别与绿色荧光蛋白基因gfp和潮霉素抗性基因hph连接构建表达载体pGlg-gfp和pGlq-hph;设置潮霉素浓度梯度在3种培养基中对银耳芽孢的敏感性进行测定,结果表明银耳芽孢在不同的培养基上对潮霉素的敏感性不同,在MA培养基上其最低敏感浓度为5μg/mL;采用电击法把pGlq-hph质粒转化进银耳芽孢完整细胞,假定转化子经MA筛选培养基筛选,结果表明银耳芽孢完整细胞电击转化的最佳参数为:STM电击缓冲液、银耳芽孢浓度1.0×108个/mL,电击体积200μL,表达质粒6μg,电击电压2.0kV/cm,电击后采用MB液体培养基静置预培养48h,转化率达277个/μgDNA.采用最佳电击参数把质粒pGlg-gfp和pGlg-hph按1︰1共转化银耳芽孢,转化子经过筛选培养基筛选、PCR鉴定及Southern杂交验证,结果表明受鉴定的8个转化子中有3个整合了gfp基因,其共转化率为37.5%.这3个gfp基因转化子的芽孢在激光荧光显微镜下可观察到发出强烈的荧光,表明了外源gfp基因能够在银耳芽孢中获得高效率的表达.
- 郭丽琼柳永赵姝娴刘二鲜林俊芳
- 关键词：电击转化基因表达GFP基因
- 双T-DNA表达载体转化大豆的研究被引量：17
- 2005年
- 利用含有筛选标记基因和目的基因Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的双T-DNA共转化表达载体pLIN61,经农杆菌EHA101介导,采用子叶节转化法转化大豆,使用除草剂Glufosinate作为筛选剂,获得了一批携带有玻璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转基因大豆,转化效率为2.0%,共转化频率及实际转化率分别为56.25%、1.12%。PCR检测和Southern杂交结果证明,玻璃苣D6D已经整合到大豆的基因组上。RT-PCR检测结果显示,玻璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因大豆的转录水平上得到了表达。
- 张秀春郭丽琼吴坤鑫林俊扬林俊芳
- 关键词：△^6-脂肪酸脱氢酶基因转基因大豆
- 安全选择标记的转基因食用菌研究进展被引量：15
- 2007年
- 在食用菌外源基因转化过程中,目的基因的导入常需要串联易于识别的选择标记基因,用于转化子的筛选。当筛选完成后,选择标记基因特别是抗性标记基因的存在即是多余的,甚至是有害的,存在生物安全隐患。有鉴于此,本文对获得安全选择标记基因的转基因食用菌作一综述。
- 赵姝娴林俊芳王杰郭丽琼
- 关键词：选择标记基因生物安全性
- 灰盖鬼伞组合表达紫杉醇生物合成酶基因的研究
- 紫杉醇是从红豆杉属植物树皮中提取分离出来的一种次生代谢物,具有显著抗癌效果,是目前应用最广泛的天然抗癌药物之一.但因资源匮乏,单纯从含量甚微的天然红豆杉植物中提取紫杉醇无法满足临床需求,故紫杉醇的药源问题已引起人们的极大...
- 尤琳烽郭丽琼卢俊南林俊芳黄秀琴
- 关键词：紫杉醇灰盖鬼伞代谢工程
- 草菇基因工程育种研究
- 本研究采用基因工程技术,从多种食用菌中克隆了gpd启动子,从异源生物中克隆了目的基因抗冷冻蛋白基因（afp）和多功能纤维素酶基因（mfc）,采用多种转化方法把afp基因和mfc基因导入草菇细胞中,有目的地改良现有草菇菌株...
- 林俊芳郭丽琼王杰赵风云张凯
- 关键词：草菇基因工程启动子
- 文献传递
- 银耳芽孢内源gpd启动子的克隆与功能鉴定被引量：7
- 2012年
- 利用反向长距离PCR技术从银耳(Tremellafuciformis)芽孢gpd基因出发克隆上游gpd启动子序列,将预测的gpd启动子片段与多功能纤维素基因(mfc)连接构建表达载体,与潮霉素抗性质粒pBgGl-hph共转化银耳芽孢,对拟共转化子进行酶活发酵试验。结果表明:4轮反向长距离PCR克隆得到了1761bp的上游序列,经预测启动子落在上游1000bp左右区域内,包含两个高分值的起始转录位点,将gpd启动子分成gpd-Tre1(885bp)、gpd-Tre2(708bp)、gpd-Tre3(466bp)3段区域,分别与多功能纤维素基因(mfc)构建表达载体pgTre1-mfc、pgTre2-mfc和pgTre3-mfc。拟共转化子酶活发酵试验结果发现3个表达载体的转化子均能检测到多功能纤维素酶活,转化子T1-2包含gpd-Tre1启动子大片段,整体酶活最高,CMC酶活为14.12U/mL,比出发菌株Tr01提高34.3%,比工程菌株yLes3提高25.7%,木聚糖酶活为34.8U/mL,比Tr01酶活提高26.3%,略低于yLes3。3个启动子片段均具有表达活性,相比之下885bp的大片段gpd启动子表达活性更高。
- 聂燕华林俊芳王杰尤琳烽郭丽琼
- 关键词：银耳芽孢
- 紫杉烯合酶基因遗传转化金针菇的研究被引量：6
- 2013年
- 利用紫杉烯合酶基因(ts)和潮霉素抗性基因(hph),采用PEG转化法共转化金针菇的原生质体。研究结果表明,18个拟转化子中有8个转化子同时整合了ts基因和hph基因,两个基因的共转化率为44.44%;RT-PCR鉴定结果表明,7个金针菇转化子实现了外源ts基因的转录。金针菇转化子在不含潮霉素(HmB)的PDA平板上经5次继代培养后仍检测到有HmB抗性,说明外源基因在金针菇转化子的无性繁殖(即有丝分裂)过程中是稳定的。本研究为通过基因工程手段定向、快速改良金针菇品种以及利用金针菇作为生物反应器生产一些具有重大经济价值的外源基因产物奠定了基础。
- 康林芝林俊芳黄秀琴郭丽琼梁科
- 关键词：金针菇
- 利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因大豆被引量：14
- 2006年
- 利用PCR和Southern杂交检测了161株转△6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D)的T1代植株,初步筛选出只含有功能基因(D6D)而不含有筛选标记基因(bar)的转基因大豆植株9株,为获得富含γ-亚麻酸但不含选择标记基因的转基因大豆奠定了基础,并为转基因大豆的安全性种植提供了保障。同时对无标记基因的转基因植株进行了叶片涂抹除草剂验证,探讨了叶片涂抹除草剂结合目的基因PCR检测筛选无选择标记转基因植株的可行性。
- 张秀春彭明吴坤鑫郭丽琼林俊扬林俊芳
- 关键词：双T-DNA大豆
- Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及其共转化表达载体的构建被引量：4
- 2004年
- 采用RT-PCR的方法从海南玻璃苣中克隆了Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(Δ6-dsa)。DNA序列测定结果表明,Δ6-dsa全长1347bp编码448个氨基酸。Δ6-dsa序列在genbank中采用BLAST程序进行同源序列分析,结果表明,Δ6-dsa核苷酸序列与克隆自美国德克萨斯州的玻璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列完全相同。Δ6-dsa克隆进T-easyVector后形成质粒pGΔ6-DSA。把质粒pGΔ6-DSA上的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因片段克隆进含有T-DNA和35S启动子的质粒pGIN22中,形成含有目的基因的表达载体pGIN23。把表达载体pGIN23与另一个含有T-DNA、启动子、筛选标记基因的表达载体pLPN28进行亚克隆,使得筛选标记基因和Δ6-dsa分别插入到同一质粒的2个相互独立的T-DNA内,构建成共转化表达载体pLIN61。
- 张秀春林俊芳郭丽琼
- 关键词：△^6-脂肪酸脱氢酶共转化筛选标记基因酶基因DSA
- 草菇ras启动子区域的克隆及其序列分析被引量：7
- 2004年
- 根据KajiwaraS[1]等报道的ras启动子的序列设计并合成一对特异引物,以草菇菌丝的总DNA为模板,通过PCR扩增,获得一条长约0.75kb片段。DNA序列测定结果表明,该片段长度为751bp。采用Blast软件和Promoterpredictions软件进行启动子序列结构分析,结果表明,该片段中243～293bp和539～589bp两区域为ras启动子的基础启动子区。在283bp和579bp处有两个转录起始位点,在244～247bp和292～295bp之间有2个TATAbox,在36～39bp、377～380bp、434～437bp和716～719bp之间有4个CAATbox。此外,该片段中还含有9个Gbox、12个Ibox、2个Pbox以及3个重要顺式作用元件:ABRE元件、WUN motif(基元)和HSE元件。
- 刘世强杨丽卿郭丽琼林俊芳
- 关键词：草菇克隆PCR扩增基因工程
