湖南省自然科学基金(03JJY3037)
- 作品数：1 被引量：7H指数：1
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- 相关领域：生物学更多>>
- pcDNA3.1/NT-GFP小凹蛋白1及突变体表达载体的构建及功能分析被引量：7
- 2005年
- 目的构建pcDNA3.1/NTGFP小凹蛋白1及对突变体表达载体及表达蛋白生物活性进行分析。方法采用硫化修饰引物与Pfu酶结合的高度保真性聚合酶链反应体系,自行设计多对引物,分别扩增带His标签的小凹蛋白1全长目的片段、小凹蛋白1(缺失81～101位氨基酸)突变体1片段及小凹蛋白1(缺失143～156位氨基酸)突变体2片段;分别亚克隆入pcDNA3.1/NTGFPTOPO真核表达载体,转化TOP10E.coli大肠杆菌,在含氨苄的固体LB培养基上随机挑取6个克隆,分别提取质粒后,用PCR法筛选含正确插入阅读框的阳性克隆子并测序鉴定。用脂质体介导法瞬时转染入HepG2细胞,用MTT法、Westernblot法初步鉴定GFPHis小凹蛋白1及突变体重组融合蛋白的生物学活性。结果筛选得到正确pcDNA3.1/NTGFPHis小凹蛋白1及突变体表达载体,测序结果无碱基突变及阅读框移码,GFPHis小凹蛋白1及突变体重组融合蛋白具有天然表达蛋白相似的生物学活性。结论成功构建具有生物学活性的pcDNA3.1/NTGFP小凹蛋白1及突变体表达载体,为小凹蛋白1的功能研究奠定基础。
- 徐阳炎杨慧龄涂剑何淑雅廖端芳
- 关键词：小凹蛋白1聚合酶链反应
