安徽省十五科技攻关项目(a01303006)
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- EDAG-1基因真核表达载体的构建及其对细胞恶性生物学行为的影响
- 2011年
- 目的构建胚胎发育相关基因-1(EDAG-1)基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-EDAG-1,并检测其对细胞的恶性生物学行为的影响。方法应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法从白血病细胞株YAC-1中扩增到EDAG-1基因片段,构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-EDAG-1。利用克隆PCR、限制性内切酶消化进行验证。将重组pcD-NA3.1(+)-EDAG-1真核表达载体和阴性对照的空载体pcDNA3.1分别转染到NIH3T3细胞和Ba/F3细胞中,应用软琼脂集落实验检测NIH3T3细胞转染前后的集落形成能力,流式细胞术检测Ba/F3细胞不依赖白介素-3(IL-3)抗凋亡能力以及其发生的机制。结果①扩增片段与预期片段大小相符,测序结果与GenBank公布一致,克隆成功,且鉴定证实pcDNA3.1(+)-EDAG-1真核表达载体构建成功。②转染真核表达载体pcDNA3.1(+)-EDAG-1后的NIH3T3细胞集落形成能力明显增高,而对照组不能形成集落。转染后Ba/F3细胞的不依赖IL-3抗凋亡能力明显提高。③在Ba/F3-EDAG细胞中,核因子κB的DNA结合活性明显高于对照细胞,而Stat3与Stat5的磷酸化未发生明显的变化。结论成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-EDAG-1,为进一步研究EDAG-1基因在白血病和甲状腺癌细胞中的功能奠定了基础。
- 郑贤芳杨帆储著朗汪思应
- 关键词：EDAG-1克隆基因转染NF-ΚB
