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Flt3配体基因原核表达载体的构建、表达、纯化及生物学活性鉴定被引量：3: 2007年; 目的:获得人Flt3配体(FL)cDNA胞外段序列,构建表达人FL蛋白的原核重组表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。方法:提取K562细胞总RNA,利用巢式PCR技术扩增出目的cDNA序列,构建重组质粒pGEM-FL,经酶切、PCR和测序鉴定后,将rhFL基因亚克隆到原核表达质粒PQE30,构建重组表达质粒PQE30-rhFL,在大肠杆菌M15中诱导表达。用镍凝胶亲和层析方法纯化目的蛋白,Westren blotting杂交鉴定纯化蛋白,并用造血集落形成实验检测生物学活性。结果:经测序证实,获得的目的基因与GenBank公布的FL基因序列100%一致。构建的原核表达载体PQE30-rhFL在大肠杆菌M15中经1 mmol.L-1IPTG诱导后表达出相对分子质量为25000的蛋白,镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Westren blotting,在相对分子质量为25000处可见特异性着色带。结论:构建了原核表达载体PQE30-rhFL,并成功诱导了rhFL蛋白的表达,通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的rhFL蛋白。; 刘小林段秀梅方艳秋谭岩史宏博车媛媛刘力华; 关键词：配体原核表达巢式聚合酶链反应

人肝细胞癌相关抗原661基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化被引量：1: 2007年; 目的:构建人肝细胞癌相关抗原661(Hepatocellular carcinoma-associated antigens661,HCA661)原核表达载体并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白。方法:人肝细胞癌SMMC7721细胞基因组DNA经PCR扩增HCA661基因,克隆到pGEM-Teasy中进行酶切、PCR和测序鉴定;构建重组质粒pQE-HCA661,并转化大肠杆菌M15[pREP4],经IPTG诱导表达目的蛋白;镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA)纯化靶蛋白后进行Western blot鉴定。结果:目的基因经酶切和PCR鉴定结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GeneBank登录的序列完全一致;工程化大肠杆菌M15[pREP4]经IPTG诱导表达约39kD的目的蛋白。Western blot鉴定结果显示,纯化重组蛋白能够分别与抗His单克隆抗体和抗HCA661多克隆抗体特异性结合。结论:本实验成功地构建了重组原核表达质粒pQE-HCA661,工程菌表达的重组HCA661带有6×His标签,并具有免疫原性,可以用于制备单克隆抗体,或用于检测患者血清中肝细胞癌抗体以预测肿瘤恶性程度。; 李树蕾谭岩刘力华段秀梅方艳秋许淑芬; 关键词：基因克隆原核表达蛋白纯化免疫原性

CEA迷你基因原核表达及其诱导小鼠特异性淋巴细胞增殖的研究被引量：2: 2008年; 目的在原核细胞中表达人癌胚抗原（CEA）的迷你基因短肽，纯化及鉴定目的蛋白，并检测其在小鼠体内的抗原性。方法利用PCR技术从人基因组中得到一段来源于CEA的DNA序列，其中包含两个编码分别能被HLA—DR4／9、HLA—DR53以及HLA-DR4／7／9型别的人群所识别辅助性T细胞（HTL）表位的迷你基因，构建重组表达质粒pQE30-CEA625-667，在大肠杆菌M15中诱导表达。Westren Blot杂交鉴定、镍凝胶亲和层析法纯化目的蛋白。3H—TdR掺入法检测目的短肽诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应。结果CEA625-667短肽在大肠杆菌M15中以包涵体形式表达。Western—blot结果显示，在相对分子质量约6700处有表达产物与6×hismAb特异性结合带。镍柱纯化后可得到纯化的目的蛋白.3H-TdR掺入实验所得不同浓度的CEA625-667与小鼠脾细胞共孵育7～9d后的刺激指数相继达到对照组的10倍以上。结论成功诱导了CEA625-667短肽的原核表达，通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的CEA625-667短肽，并证明在一定浓度下目的短肽可于体外诱导小鼠的特异性淋巴细胞增殖。为CEA625-667迷你基因作为表位疫苗在抗肿瘤方面的进一步研究提供条件。; 李丹方艳秋谭岩刘力华段秀梅许淑芬; 关键词：癌胚抗原表位大肠杆菌

构建人肝细胞癌相关抗原HCA661和mtHSP70刺激表位的融合基因疫苗被引量：2: 2007年; 目的:构建人肝细胞癌相关抗原661(HCA661)与牛型结核分枝杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)刺激表位的融合基因疫苗。方法:通过PCR技术扩增HCA661基因,定向克隆至真核表达质粒pCI-neo后测序。通过PCR技术从牛型结核分支杆菌基因组中扩增包含mtHSP70刺激表位的DNA片段,亚克隆至pGEM-Teasy后测序。将该刺激表位片段插入pCI-HCA661中HCA661下游,利用PCR和酶切方法鉴定重组真核表达质粒pCI-HCA661-mtHSP70E。结果:HCA661 PCR扩增产物为1040 bp,mtHSP70表位PCR产物为312 bp,测序结果均分别与GenBank登记的序列完全相同。PCR和酶切鉴定结果表明,构建的重组真核表达质粒pCI-HCA661-mtHSP70刺激表位中含有正确编码的融合基因片段。结论:成功构建含有人肝细胞癌相关抗原HCA661-mtHSP70刺激表位的融合基因疫苗。; 李玉琴谭岩李树蕾刘力华段秀梅方艳秋许淑芬; 关键词：分枝杆菌热休克蛋白70 表位

CEA迷你基因串联体肿瘤疫苗的构建被引量：3: 2007年; 目的:构建人癌胚抗原(CEA)的迷你基因串联体肿瘤疫苗。方法:通过PCR从人基因组中得到一段来源于CEA的DNA序列,其中包含两个编码辅助性T细胞(HTL)表位的迷你基因,插入pGEM-T easy载体后测序,再将目的基因以同尾酶连接的方式顺次定向亚克隆到真核表达载体pcDNA3.0中,得到三串联体,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pcDNA3.0-triCEA625-667。结果:PCR和酶切结果表明,获得的目的基因与所选的基因片段CEA625-667中包含的碱基数量吻合,且带有正确的酶切位点。测序结果与GenBank登记完全相同。构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的经同尾酶连接的目的基因片段三倍体。结论:成功地构建了含有CEA625-667基因三串联体的DNA疫苗。; 李丹谭岩刘力华段秀梅方艳秋许淑芬华树成; 关键词：癌胚抗原表位癌症疫苗

基因佐剂结核杆菌HSP70增强HCA661基因疫苗免疫应答被引量：7: 2008年; 目的:评价结核分枝杆菌HSP70(Mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,mtHSP70)羧基端作为基因佐剂对HCA661(Hepatocellular carcinoma associated antigens 661)基因疫苗免疫效果的影响。方法:将HCA661及与mtHSP70羧基端的串联体分别克隆到pCI-neo中构建基因疫苗;将eGFP及与mtHSP70羧基端的串联体分别克隆到pCI-neo,体外转染φA细胞,根据eGFP的表达评价重组质粒中靶基因的转录表达效率。基因疫苗免疫BALB/c小鼠,SABC、Western blot检测免疫血清中特异性HCA661抗体;流式细胞术、ELISA法检测免疫血清中特异性HCA661抗体水平。结果:重组质粒构建成功;80%φA细胞转染eGFP后呈现绿色荧光;单基因和融合基因疫苗组动物均产生了针对HCA661的特异性抗体,融合疫苗组诱导的抗体水平较单基因疫苗组显著增高,融合基因疫苗组未产生针对mtHSP70的抗体。结论:mtHSP70羧基端作为基因佐剂增强机体对HCA661融合基因疫苗的特异性免疫应答。; 李树蕾谭岩刘力华段秀梅方艳秋许淑芬车媛媛; 关键词：融合基因疫苗基因佐剂

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长春市科技计划项目(2004218)