国家自然科学基金(81070423)
- 作品数：10 被引量：27H指数：4
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- Hsa-mir-216a真核表达载体的构建及其在胃癌细胞SGC7901/DDP中的表达
- 2011年
- 目的:构建人mir-216a真核表达载体,实现其在胃癌细胞SGC7901/DDP中的表达,为进一步研究mir-216a的功能打下基础。方法:依据miRBase数据库中pre-mir-216a序列设计引物;PCR扩增pre-mir-216a基因并将其克隆至pGenesil-1载体;将pGenesil-1-hsa-mir-216a质粒转染SGC7901/DDP细胞,RT-PCR及实时定量RCR法检测成熟mir-216a在SGC7901/DDP细胞中的表达。结果:pGenesil-1-hsa-mir-216a质粒经酶切及测序鉴定正确;pGenesil-1-hsa-mir-216a质粒转染进SGC7901/DDP细胞后,RT-PCR检测mir-216a成熟体表达明显增强,实时定量PCR检测S/D/mir-216a组mir-216a成熟体表达较S/D/HK组上调(63.530±0.159)倍(t=1.201,P<0.01)。结论:成功构建了pGenesil-1-hsa-mir-216a真核表达质粒,并在胃癌细胞SGC/DDP中高效表达。
- 徐红美许文林姚俊冷加燕吴晓君陈巧云
- 关键词：真核表达载体转染
- YB-1腺病毒载体的构建及其对乳腺癌MCF-7细胞耐药性的影响被引量：2
- 2011年
- 目的:构建携带人YB1基因的重组腺病毒载体,并观察其对乳腺癌细胞株MCF-7药物敏感性的影响,并分析其可能的机制。方法:设计含有BglⅡ和HindⅢ酶切位点的引物,PCR克隆人YB1基因,插入穿梭载体pAdTrack-CMV,与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183内同源重组,获得重组子pAdEasy-1-hYB1,转染293A细胞,包装获得含hYB1的重组腺病毒(AdYB1),体外转染MCF-7细胞。采用MTT法分析在As2O3作用下YB1对MCF-7细胞半数抑制浓度(IC50)的影响;采用Annexin V/PI双染法,经流式细胞仪分析在As2O3作用下YB1对MCF-7细胞凋亡的影响。结果:成功构建了含有hYB1基因的腺病毒载体AdYB1,该重组腺病毒能显著提高MCF-7细胞的YB1mRNA及蛋白的表达水平,转染YB1组能够增加MCF-7细胞对AS2O3的IC50值;通过Annexin V/PI检测证实YB1能够抑制早期细胞凋亡。结论:成功构建含有hYB1基因的腺病毒载体AdYB1,能高效感染MCF-7,并通过抑制早期细胞凋亡提高MCF-7细胞对As2O3的耐药性。
- 冷加燕许文林沈慧玲龙璐璐吴晓君陈巧云姚俊
- 关键词：MCF-7细胞腺病毒载体耐药
- 雷公藤甲素通过调节microRNA21的表达干预K562/A02细胞的化疗敏感性被引量：4
- 2012年
- 目的:研究雷公藤甲素对K562/A02细胞多药耐药性的逆转作用,并探讨其机制。方法:四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测雷公藤甲素细胞毒性;采用非毒性浓度雷公藤甲素作用于K562/A02细胞,AnnexinV/PI双标法检测细胞凋亡;荧光定量PCR检测microRNA21表达水平;蛋白印迹法检测Bcl-2蛋白表达水平。microRNA21反义寡核苷酸转染K562/A02细胞,观察细胞增长率,凋亡率和Bcl-2表达的变化。结果:非毒性浓度(5 nmol/L)雷公藤甲素明显增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性,并能增强多柔比星诱导细胞凋亡的作用,使K562/A02细胞平均凋亡率由4.3%明显上升到18.5%(P<0.05);雷公藤甲素作用后,microRNA21和Bcl-2蛋白水平降低;microRNA21反义寡核苷酸转染K562/A02细胞后,降低了Bcl-2表达,提高多柔比星敏感性和多柔比星诱导的细胞凋亡。结论:雷公藤甲素增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性,并诱导其凋亡,可能与下调microRNA21水平有关。
- 惠璐璐许文林沈慧玲陈巧云朱小兰龙璐璐徐颖
- 关键词：雷公藤甲素多柔比星
- 雷公藤甲素对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响被引量：4
- 2012年
- 本研究旨在探讨雷公藤甲素(TPL)对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响。采用MTT法检测TPL细胞毒性和阿霉素药物敏感性;流式细胞术检测P-糖蛋白表达和细胞内阿霉素浓度;双荧光素酶报告基因系统检测MDR1启动子活性。结果表明:TPL增强K562/A02细胞阿霉素敏感性。TPL作用后,K562/A02细胞P-糖蛋白表达相关平均荧光强度(MFI)由123±13下降到39±13(P<0.05);K562/A02细胞内阿霉素相关MFI由18±5上升到34±6(P<0.05),TPL能够有效抑制K562/A02细胞的药物外排。TPL降低MDR1启动子转录活性约75%。结论:TPL通过下调P-糖蛋白表达增强K562/A02细胞对阿霉素的敏感性,其有可能成为一种耐药逆转剂。
- 惠璐璐许文林陈巧云朱小兰龙璐璐徐颖秦蓉
- 关键词：雷公藤甲素K562/A02细胞株阿霉素多药耐药
- 汉防己甲素预防K562细胞获得性耐药机制的研究被引量：6
- 2011年
- 本研究从MDR1基因转录调控和细胞凋亡两方面探讨汉防己甲素(TTD)预防K562细胞阿霉素(ADM)诱导性多药耐药(MDR)产生的作用机制。本实验分3组,第1组为K562细胞空白对照组;第2组用ADM作用K562细胞24小时诱导细胞耐药;第3组采用TTD预处理K562细胞24小时后,再用ADM诱导耐药。采用RT-PCR检测各组细胞转录因子c-Jun、YB-1及Survivin的mRNA表达水平;Western blot法检测c-Jun、YB-1的核内蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞的凋亡程度。结果表明,0.6μg/ml阿霉素作用后K562细胞MDR1基因转录上调;与空白对照组(第1组)相比,ADM诱导的耐药细胞组(第2组)c-Jun mRNA和蛋白表达减低(p均<0.05),YB-1 mRNA和蛋白表达明显上调(p均<0.05);Survivin mRNA表达无明显差异(p>0.05);细胞凋亡率(8.31%)比空白对照组(0.75%)稍有增加;TTD预处理后再用ADM诱导组(第3组)与ADM作用组相比,c-Jun mRNA和蛋白表达增加(p均<0.05);YB-1 mRNA和蛋白表达下调(p均<0.05);Survivin mRNA表达明显减少(p<0.05),细胞凋亡率(97.2%)明显增加。结论:TTD预防白血病细胞耐药形成的机制可能与其下调YB-1基因和蛋白的表达、上调c-Jun基因和蛋白的表达,从而下调MDR1基因表达有关,另外,TTD与ADM联合作用还能抑制Survivin的表达,增加白血病细胞的凋亡。
- 朱小兰许文林吕旭晶罗文娟周磊磊陈巧云
- 关键词：K562细胞汉防己甲素C-JUNYB-1
- 无血清培养联合多柔比星诱导A549细胞耐药
- 2012年
- 目的:探索快速建立肺癌耐药细胞模型的新方法,并探讨肺癌耐药和干细胞的相关性。方法:应用无血清培养联合药物筛选法建立肺腺癌细胞耐药株A549/ADM;MTT法检测其对多种常用化疗药物的耐药程度;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡、ABCB1和ABCG2的表达水平及细胞内多柔比星的浓度;细胞免疫荧光及流式细胞仪通过特异性表面抗原标记法(CD133)检测肿瘤干细胞含量。裸鼠皮下种植瘤试验评估A549/ADM的致瘤性。结果:A549细胞经无血清培养可见细胞球形成;A549/ADM细胞对多柔比星、长春新碱、紫杉醇均产生了耐药,其耐药指数分别为A549的13.167,12.86,3.4倍;与亲代A549相比,耐药株A549/ADM S期细胞比例由(45.76±1.41)%降低至(23.33±1.32)%,细胞凋亡百分率由(58.23±0.82)%减少至(16.49±0.77)%;耐药株A549/ADM中ABCB1和ABCG2的表达水平明显增高(P<0.05),且细胞内多柔比星浓度明显低于A549细胞;CD133细胞在A549/ADM和A549中的比例分别为(6.2±0.7)%和(1.9±0.2)%(P<0.05),免疫荧光检测A549/ADM细胞CD133表达水平较A549细胞高;A549/ADM具有高致瘤性。结论:无血清培养联合多柔比星诱导能高效富集肺癌干细胞,成功建立了人肺腺癌A549/ADM多药耐药细胞模型。
- 秦蓉许文林惠璐璐朱小兰龙露露陈巧云曹渊
- 关键词：多药耐药肿瘤干细胞多柔比星
- YB-1蛋白对白血病细胞K562/A02生物学行为的影响
- 2011年
- 本研究探讨YB-1基因表达下调后对白血病细胞K562/A02生物学行为的影响及其机制。采用脂质体介导的方法将已构建的人YB-1基因特异性shRNA及随机片段HK的真核表达载体转染进白血病细胞K562/A02中,RT-PCR和免疫印迹反应检测YB-1 mRNA和蛋白表达量的改变;采用MTT法和细胞周期测定分析对白血病细胞增殖的影响;用AnnexinⅤ检测白血病细胞的凋亡程度;采用MTT法检测细胞IC50值变化;RT-PCR和流式细胞术检测基因转染前后细胞中的MDR1 mRNA和P-gp表达的变化。结果表明,阳性转染的3组细胞YB-1基因和蛋白的表达量明显低于随机片段组和未转染细胞;生长曲线提示阳性转染组细胞生长缓慢,细胞周期动力学分析显示阳性转染组G1期细胞增多,G2期与S期细胞显著减少;在小剂量As2O3作用下,阳性转染组细胞的凋亡数量明显高于对照组细胞;阳性转染细胞的阿霉素IC50明显低于随机片段组和阴性对照组;阳性转染细胞MDR1 mRNA水平明显降低,P-gp的峰值较对照组明显左移。结论:YB-1特异性shRNA能有效降低白血病细胞中YB-1的表达,减慢细胞生长,增加白血病细胞对化疗药物的敏感性,加速细胞凋亡。
- 沈慧玲周磊磊陈巧云陈琛方丽丽房新建许文林
- 关键词：YB-1蛋白白血病细胞细胞增殖细胞凋亡
- YB-1抑制三氧化二砷诱导的胃癌细胞自噬机制被引量：3
- 2012年
- 目的研究YB-1抑制三氧化二砷(As2O3)诱导人胃癌BGC-823细胞自噬的机制。方法采用脂质体转染siRNA干扰YB-1和腺病毒转染pAd1Easy/YB-1过表达YB-1;实时荧光定量PCR检测Bcl-2和Beclin1基因转录;Western blot检测YB-1、Bcl-2、Beclin1、P62和LC3Ⅱ蛋白的表达;MDC染色、荧光显微镜观察自噬泡。结果与空病毒(AdGFP)组相比,pAd1Easy/YB-1(AdYB-1)组Bcl-2基因表达增高,而干扰质粒(siYB-1)组Bcl-2基因表达水平较空质粒(HK)组降低(P均<0.05),各组Beclin1基因表达比较无统计学差异。与AdGFP和HK组相比,AdYB-1组Beclin1和LC3Ⅱ蛋白减少,Bcl-2和P62蛋白增加(P均<0.01),siYB-1组Beclin1和LC3Ⅱ蛋白增加,Bcl-2和P62蛋白减少(P均<0.01)。与AdGFP组相比,AdYB-1组自噬泡聚集减少,加入Bcl-2抑制剂HA14-1后自噬泡重新聚集,Beclin1蛋白恢复表达,P62降解增加,LC3Ⅱ升高。结论 YB-1可能通过上调Bcl-2、抑制Bec-lin1,实现对As2O3诱导的BGC-823细胞自噬的抑制。
- 龙璐璐许文林沈慧玲冷加燕
- 关键词：三氧化二砷自噬YB-1BCL-2BECLINL
- 汉防己甲素诱导人胃癌BGC-823细胞自噬和凋亡的作用及机制被引量：6
- 2013年
- 目的观察汉防己甲素诱导人胃癌BGC-823细胞自噬与凋亡的作用,并探讨两者发生以及相互关联的分子机制。方法用不同浓度的汉防己甲素作用于人胃癌BGC-823细胞,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞增殖率;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western-blot法检测各组细胞Bcl-2和自噬标记蛋白LC3、Beclin1的表达,MDC自噬特异性染料荧光染色观察自噬泡的聚集。结果 TET对BGC-823细胞的生长有显著抑制作用,呈明显的时间、剂量依赖性;TET可诱导BGC-823细胞发生凋亡;TET可诱导BGC-823细胞发生自噬,自噬作用在8、10μg/mL TET给药组达到高峰,后随着浓度的增加逐渐下降;在TET给药前用3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻断自噬后,低浓度(8μg/mL)TET诱导的凋亡率明显升高;高浓度(20μg/mL)TET诱导的凋亡率差别无统计学意义。结论 TET能明显抑制人胃癌BGC-823细胞的生长,并诱导其发生凋亡和自噬。TET诱导的自噬作为保护性机制,可发挥拮抗凋亡的作用。
- 方悦曹渊秦蓉沈慧玲许文林
- 关键词：汉防已甲素自噬凋亡
- 雷公藤甲素通过抑制microRNA-21的表达提高SGC7901/CDDP细胞顺铂敏感性被引量：2
- 2012年
- 目的:观察雷公藤甲素对胃癌SGC7901/CDDP细胞顺铂敏感性的影响,并探讨其机制。方法:采用非毒性浓度雷公藤甲素作用于SGC7901/CDDP细胞,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞增长率;荧光定量PCR检测microRNA-21表达;蛋白质印迹法检测Bcl-2蛋白表达;AnnexinV/PI双标法检测细胞凋亡。将microRNA-21反义寡核苷酸转染SGC7901/CDDP细胞,观察其对细胞增长率、凋亡和Bcl-2表达的影响。采用小干扰RNA转染实验证明Bcl-2与胃癌耐药的关系。结果:非毒性浓度雷公藤甲素可提高SGC7901/CDDP细胞对顺铂敏感性,并且降低mi-croRNA-21的表达。microRNA-21反义寡核苷酸转染SGC7901/CDDP细胞后,降低Bcl-2表达,提高顺铂敏感性和顺铂诱导的细胞凋亡。小干扰RNA实验证明Bcl-2水平与SGC7901/CDDP细胞顺铂耐药有关。结论:雷公藤甲素通过降低microRNA-21的表达,抑制Bcl-2蛋白表达,促进顺铂诱导的细胞凋亡,从而提高胃癌SGC7901/CDDP细胞顺铂敏感性。
- 龙璐璐许文林沈慧玲方悦
- 关键词：雷公藤甲素MICRORNA-21BCL-2顺铂胃癌细胞
