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壳聚糖对异育银鲫和中华绒螯蟹淋巴细胞部分特性的影响被引量：1: 2009年; 通过体外及体内实验2种途径,探讨了壳聚糖对异育银鲫(Carassius auratus gibelio)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的血淋巴细胞部分特性的影响。体外实验通用3H-TdR、14C-UR、3H-Val掺入法研究了不同剂量[0μg/mL(对照)、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL]的壳聚糖对异育银鲫PHA和LPS刺激的淋巴细胞DNA、RNA和蛋白质增殖的影响。结果表明,随着蟹血淋巴中壳聚糖剂量的增加,检测到3H-TdR、14C-UR、3H-Val的放射强度逐渐增强,当壳聚糖终质量浓度达20μg/mL时,PHA和LPS刺激的DNA、RNA、蛋白质增殖作用达到最大值,而壳聚糖的终质量浓度达到100μg/mL时,放射强度低于不添加壳聚糖时,表明此时的壳聚糖剂量抑制了淋巴细胞DNA、RNA和蛋白质的增殖。同样,随着鲫血淋巴中壳聚糖剂量的增加,检测到3H-TdR、14C-UR、3H-Val的放射强度也逐渐增强,当壳聚糖终质量浓度达10μg/mL时,经PHA和LPS刺激的放射强度达峰值,其每分钟放射性计数(cpm)分别为11133、8882,8457、6726,5964、4286,而壳聚糖的终质量浓度达到100μg/mL时放射强度甚至低于不添加壳聚糖时,表明此时的壳聚糖剂量抑制了淋巴细胞DNA、RNA和蛋白质的增殖。同时,利用流式细胞仪技术,检测了以壳聚糖(100mg/kg)投喂鲫和蟹不同时间(7～30d)后淋巴细胞的细胞周期(Cellscycle)、增殖指数(PI)和凋亡指数(AI)的变化情况。结果表明,各采样时间蟹淋巴细胞的细胞周期、增殖指数(PI)和凋亡指数(AI)与对照组无显著差异(P>0.05);日粮中添加壳聚糖后对鲫淋巴细胞AI没有显著影响(P>0.05),但对PI则显著提高(P<0.05),对鲫淋巴细胞周期中的G2/M和S时相的比例显著或极显著提高。实验结果提示,壳聚糖可促进鲫和蟹淋巴细胞的增殖,从而增强其免疫机能,但不同水产动物对壳聚糖的免疫刺激作用敏感性不同。; 郑宗林黄辉刘鸿艳吴国忠杨先乐; 关键词：壳聚糖异育银鲫中华绒螯蟹淋巴细胞流式细胞仪

草鱼体外培养细胞中β-萘黄酮对CYP1A基因表达的诱导被引量：3: 2010年; 为了建立以CYP1A cDNA为探针的水环境毒理学细胞模型,以β-萘黄酮(BNF)作为诱导剂,通过半定量PCR技术研究CYP1A在草鱼不同细胞系及其对应组织中的诱导表达情况。在半定量PCR反应参数研究中,对关键的退火温度和循环次数进行了优化,结果显示退火温度为57℃,循环次数为30次较为合适,该条件下Gauss迹量的CYP1A/ACT比值能更准确的反映CYP1A的表达水平。对照组和诱导组草鱼细胞中ACT和CYP1A cDNA扩增结果表明,细胞中CYP1A的基础表达量较低,而BNF诱导使GCL、CIK和CO细胞中CYP1A的表达水平得到显著的提高。GCL、CIK和CO细胞三者之间诱导后CYP1A的表达水平有显著差异(P<0.05),诱导表达量大小顺序为GCL>CIK>CO。草鱼细胞系的相应组织中ACT和CYP1A cDNA扩增以及电泳的结果与细胞中较为相似,组织中CYP1A诱导表达量大小顺序也与相应的细胞相同:肝>肾>卵巢。比较分析的结果表明,CYP1A在体内与体外的诱导表达水平具有一定的相关性。; 林茂杨先乐纪荣兴; 关键词：草鱼细胞 CDNA

草鱼肝细胞系中CYP3A活性检测方法被引量：3: 2007年; 红霉素-N-脱甲基酶(ERND)是细胞色素P450 3A(CYP3A)依赖的酶类,可通过测定该酶催化代谢产物甲醛的量来反映其活性,从而评价CYP3A活性的高低。以草鱼肝细胞系(GCL)为模型,红霉素为底物,采用Nash比色法检测ERND产物甲醛含量,Lowry比色法测定细胞蛋白含量,建立鱼类细胞中CYP3A活性的简便检测方法。研究表明,底物以0.4 mmol/L作用60 m in后进行检测较为合适。细胞样品中ERND产物甲醛平均回收率为78.80%±4.37%,平均日内精密度为2.80%±1.40%,平均日间精密度为3.91%±1.45%,通过计算探针酶ERND活性可为鱼类细胞CYP3A活性的评价提供简便可靠的方法,从而为鱼类药物代谢酶体外诱导模型的研究奠定了基础。; 李聃杨先乐张书俊喻文娟陈昱; 关键词：细胞色素P4503A 鱼类细胞甲醛

大口黑鲈肝细胞中恩诺沙星的消除及其代谢酶活性的测定被引量：4: 2007年; 建立了反相高效液相色谱法检测大口黑鲈(Micropterus salmoides)原代肝细胞中恩诺沙星(Enrofloxacin,EF)代谢情况的方法,并通过其代谢产物环丙沙星(Ciprofloxacin,CF)来间接反映恩诺沙星N-脱乙基酶的活性。采用二氯甲烷提取细胞中的药物,正己烷去脂,反相高效液相色谱法测定其中的药物浓度。经测得该方法样品回收率均大于80.28%,日间变异系数小于5.54%。通过EF与大口黑鲈肝细胞进行孵育,发现EF在细胞中的消除方程为C=50e-0.0008t,消除半衰期(T1/2)为86.63 h,消除速率常数(K)为8×10-4/h。对孵育过程中的酶活研究发现最佳孵育时间为45 min,其酶活性为0.25μg/(min.mg),酶动力学参数中最大反应速率(Vmax)为0.29μg/(min.mg),米氏常数(Km)为22.37μg/mL,内在清除率(Clint)为0.01 mL/(min.mg)。结果表明,该酶与底物结合力不强,酶促反应强度较弱,EF在大口黑鲈肝细胞中的代谢较缓慢。; 王翔凌杨先乐林茂喻文娟张宁张书俊; 关键词：大口黑鲈肝细胞恩诺沙星反相高效液相色谱法酶活

大口黑鲈原代肝细胞的培养及其应用于CYP450活性的诱导被引量：7: 2008年; 体外培养大口黑鲈（Micropterus salmoides）原代肝细胞，观察其在培养过程中的形态变化，同时检测培养上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）、白蛋白（ALh）含量，从而判定肝细胞的增殖和代谢能力，进而应用于CYP450的诱导研究。结果表明：培养5d后，肝细胞连接成片，分裂增多；培养至7d，细胞渐至单层；14d后，细胞停止生长，出现老化迹象。培养至第3—4天的细胞上清液中LDH的渗出量呈上升趋势，在第4天时达到峰值，随着培养时间的延长，肝细胞的酶渗出量逐渐减少。ALh的分泌量在第3—5天呈上升的趋势，第4—8天维持在较高水平，在第5天达到最高，此后随着培养时间的延长，ALb的分泌量呈下降趋势，故选择培养至第5天的大口黑鲈肝细胞应用于CYP450酶系中的氨基比林-N-脱甲基酶（ANDM）的诱导研究。40μM利福平诱导24h后，ANDM活性最高。ANDM的诱导研究为鱼类细胞药物代谢酶体外诱导奠定基础。; 喻文娟李聃王翔凌张宁邱军强杨先乐; 关键词：大口黑鲈肝细胞原代培养乳酸脱氢酶白蛋白

草鱼肝细胞中细胞色素P450 3A的酶促动力学被引量：1: 2008年; 用分光光度计法和反相高效液相色谱法研究了草鱼肝细胞系(GCL)中 CYP3A 探针酶类红霉素-N-脱甲基酶(ERND)和6β-睾酮羟化酶(6β-TOH)的酶促反应。药物利福平(RIF)在浓度为40μM时对 GCL 细胞中 CYP3A 活性具有显著诱导作用,而苯巴比妥(PB)和地塞米松(DEX)无显著诱导作用(P<0.05)。在低浓度底物条件下,对照组和40μMRIF 诱导组 GEL 细胞中 ERND 的酶促动力学方程分别为1/V=234.08×1/[S]+2.6544和1/V=85.632×1/[S]+1.9458,6β-TOH 的酶促动力学方程分别为1/V=529.91×1/[S]+14.615和1/V=56.337×1/[S]+2.1017;酶动力学参数表明,RIF 诱导的 CYP3A 亲和力较强,催化效能较高。当底物浓度进一步增高,EYP3A 活性反而降低,致使动力学曲线偏离经典的米氏动力学曲线,该结果表明 GCL 细胞中 CYP3A 存在特殊的负协同效应,这一现象是对鱼类细胞色素 P450(CYP)酶促动力学的有利补充。; 李聃杨先乐张书俊胡鲲林茂邱军强; 关键词：细胞色素P450 酶促动力学利福平

兰科丝核菌类真菌对铁皮石斛生长的影响被引量：16: 2007年; 将初步鉴定为隶属于兰科丝核菌类瘤菌根菌属(Epulorhizasp.)的GDB254和角菌根菌属(Cerato-rhizasp.)的MLX102、CLN103真菌菌株接种到铁皮石斛组培苗,65 d后测定对铁皮石斛生长均有明显的促进作用,接菌苗的平均鲜重净增率均高于对照,且经检验接菌苗与对照均达极显著差异(α=0.01)。叶绿素a、b含量也较对照有明显增加,其中GDB254菌株接种铁皮石斛后其叶绿素a、b含量分别增加76.2%、128.0%,MLX102使其增加84.9%、85.4%,CLN103使其增加57.9%、77.8%。通过徒手切片光学显微镜观察菌根,菌根真菌先在根外聚集并通过破坏根被入侵到皮层组织,在皮层组织细胞中通过菌丝穿越细胞壁不断延伸扩展,可侵染到中柱组织,并可在皮层和中柱细胞形成典型的菌丝结结构。从铁皮石斛生长量和叶绿素含量增加及根的显微结构表明,3个菌株确与铁皮石斛形成了共生菌根,并对其生长有明显促进作用。; 亢志华韩素芬韩正敏; 关键词：铁皮石斛菌根

草鱼肝细胞中诱导剂对EROD作用的剂量效应研究被引量：5: 2006年; 在研究GCL细胞中EROD催化底物反应时间的基础上分别以三种数学模型拟合,分析比较了诱导剂TCDD、PCB、PB、BaP、3-MC、BNF对GCL细胞EROD酶活的剂量-效应曲线,结果表明Log-Normal模型能较好的拟合药酶诱导前升后降的钟形效应曲线,所得方程参数值p100和EC100可用于药物代谢酶的诱导研究;Gentox模型拟合度相对较低且其EC50值显著高于半效应浓度;Logistic模型只能拟合曲线诱导上升部分而且EC50和p100与Log-Normal模型相比显著偏高。进一步研究结果显示诱导剂TCDD对GCL细胞作用时间越长,EC100越大,p100越小,但在作用48h后即达到较大诱导效应,延长时间并无显著加强作用。; 林茂杨先乐房文红张宁李聃; 关键词：药物代谢酶

草鱼肝细胞中CYP2E1活性的诱导研究被引量：2: 2008年; CYP2E1为代谢大部分药物及环境中毒物的关键酶。以草鱼肝细胞(Ctenopharyngodon idellushepatocyte)为反应体系,选取氯唑沙宗(CZX)为底物,采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定其产物6-OH-氯唑沙宗(HCZX)的量,Lowry法测定肝细胞中蛋白的浓度从而反映CYP2E1活性,并采用该酶特异性诱导剂乙醇对其进行诱导,观察其酶活变化及CZX在细胞中代谢情况。结果表明,CZX在草鱼肝细胞中的基础代谢较低,经过对CYP2E1诱导条件的优化及筛选,得到最佳诱导剂剂量为4μg/mL、诱导时间为24h、底物浓度为50μg/mL并且孵育时间为1h时,其酶活达到最高,约为0.47μg/min.mg。对照组和诱导组的草鱼肝细胞中CZX的消除半衰期(t1/2)分别为202.10h和28.75h,差异极显著,表明乙醇诱导的CYP2E1能够加快底物的代谢。酶促反应动力学参数表明乙醇诱导的CYP2E1与底物的亲和力较高,酶促反应强度较大。该结果能够为CYP2E1代谢的药物及环境毒物的研究提供理论依据。; 王翔凌杨先乐张宁喻文娟胡鲲; 关键词：反相高效液相色谱法 CYP2E1 氯唑沙宗

MTT比色法在药物对鱼类细胞的毒性检测中的应用被引量：7: 2007年; MTT检测的OD值与细胞量之间呈显著的线性正相关(R2>0.96),能较好地反映活细胞密度。MTT的作用浓度及反应时间对此OD值均有较大影响,根据实验结果在细胞的MTT检测中,采用0.5 mg/mL为MTT作用浓度,4 h为反应时间。细胞接种量对最终的细胞活力有一定影响,根据实验结果在鱼类细胞毒性实验中,选取每孔2.0×104为最初接种量(初始密度为105cell/mL),对照SMMC7721细胞则选择每孔0.5×104细胞接种量(初始密度为2.5×104cell/mL)。通过优化的MTT比色法检测抗生素和多环芳香烃等药物对细胞的毒性,药物的剂量-效应曲线以Logistic模型拟合,获得实验药物对不同细胞的半致死浓度IC50,结果表明,多环芳香烃的毒性通常大于抗生素,研究还发现药物对C IK、GCL、PCK细胞的IC50显著高于SMMC7721细胞(P<0.05)。; 杨先乐林茂喻文娟王翔凌房文红; 关键词：噻唑蓝鱼类毒性

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国家自然科学基金(30371109)

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