国家自然科学基金(30471546)
- 作品数：11 被引量：18H指数：3
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- 赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白新基因ompL17基因靶向敲除及其突变株的构建被引量：5
- 2005年
- 目的将外膜蛋白新基因ompL17靶向敲除并构建该基因的突变株。方法提取钩端螺旋体017株基因组DNA,扩增出外膜蛋白新基因ompL17,与打靶载体p2NIL重组,并插入氨苄抗生素抗性基因Ampr+使外膜蛋白新基因ompL17失活,构建重组的基因打靶质粒p2NIL17A。电穿孔转化入钩体017株中构建突变株,通过豚鼠模型观察该突变株的毒力变化。结果PCR、Dotblot和酶切分析,证实构建了以氨苄青霉素抗性基因DNA为标记探针的基因打靶载体,并构建外膜蛋白新基因ompL17敲除的钩体017株突变株。结论成功将钩体外膜蛋白的新基因ompL17进行靶向敲除,并构建钩体017株突变株,为进一步进行该基因的功能研究和阐明赖型钩体致病的分子机制奠定了基础。
- 张会东鲍朗赵计林朱庆平李娅莎
- 关键词：钩端螺旋体基因打靶突变株赖型钩端螺旋体新基因靶向
- 赖型钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL41基因真核表达质粒的构建及表达被引量：1
- 2007年
- 目的:构建赖型钩端螺旋体LipL41基因的真核重组表达质粒、并对其表达进行检测。方法:以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板PCR扩增目的基因,克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1上。测序分析后酶切,并连接至真核表达质粒pcDNA3上,构建真核重组表达质粒LipL41-pCDNA3。利用脂质体介导转染COS7细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR检测其表达。结果:PCR扩增出1 011 bp大小的目的片段,序列分析显示它与Leptospira kirschneri的LipL41基因成熟肽序列同源性高达98%。酶切鉴定证实真核重组表达质粒LipL41-pCD-NA3构建成功,RT-PCR检测显示,LipL41-pCDNA3转染组在大约1kb处出现特异的扩增带,而空质粒组无此条带。结论:LipL41的真核重组表达质粒构建成功,并可在哺乳动物细胞中表达。
- 朱海龙鲍朗李学敏张会东
- 关键词：钩端螺旋体属基因真核表达
- 构建Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体被引量：4
- 2007年
- 目的:构建赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因去信号肽片段的原核表达载体,并对其进行克隆表达。方法:实验于2004-12/2005-12在四川大学华西医学中心感染免疫研究室完成。以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板,PCR扩增Loa22基因去信号肽片段,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,经双酶切、PCR鉴定,筛选出阳性重组质粒克隆。经DNA测序正确后,转化大肠杆菌,利用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定表达产物。结果:PCR获得长516bp的片段。Loa22基因去信号肽片段与pGEX-4T-1的重组质粒构建成功。重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中表达Mr45000的融合蛋白。结论:制备了Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体,为钩体新型疫苗的研究奠定基础。
- 朱海龙鲍朗张会东
- 关键词：钩端螺旋体OMPA信号肽原核表达
- 钩端螺旋体LAg42膜蛋白基因的克隆及原核表达
- 2007年
- 分别以问号状赖型钩体017株,56601株及双曲钩体PatocI株基因组为模板,PCR扩增目的基因lag42与质粒pET32a(+)构建重组原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达.结果显示不同毒力赖型钩体均能扩增出约1100 bp的片段,而PatocI株则未能扩增出目的片段;不同赖型钩体的lag42基因的同源性很高.融合表达质粒pET-lag42转化大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导,表达出约62kDa的重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体.
- 刘鱼鲍朗商正玲钟琪
- 关键词：钩端螺旋体克隆
- 赖型钩端螺旋体LipL32-HlyX融合基因真核表达载体的构建及在COS7细胞中融合表达的研究
- 2009年
- 从赖型钩端螺旋体017株全基因组中通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)分别扩增出脂蛋白32(LipL32)和溶血素-X(HlyX)基因,应用重叠延伸PCR技术(Gene splicing by overlap extension PCR,SOEPCR)获得LipL32-HlyX融合基因。以pcDNA3.1为载体,LipL32-HlyX为目的基因,双酶切构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经双酶切、PCR及测序鉴定证实重组质粒构建成功。脂质体转染法将构建成功的重组质粒转染COS7细胞,RT-PCR扩增出约2000bp的目的基因,Western blotting分析发现在75KD处出现特异性的阳性条带。结果证实赖型钩端螺旋体LipL32-HlyX融合基因真核表达载体能在哺乳动物细胞中表达,为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础。
- 黄毕鲍朗钟琪张会东张英
- 关键词：钩端螺旋体真核表达
- 赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白LipL32基因重组质粒的构建及其细胞毒性的研究
- 2008年
- 目的构建赖型钩端螺旋体(钩体)017株外膜蛋白LipL32基因的重组质粒,并研究其细胞毒性。方法从钩体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌,诱导表达LipL32蛋白,将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western Blotting鉴定其免疫原性。将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞,通过检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)、NO释放量研究其细胞毒性。结果扩增出816bp的LipL32基因,重组质粒经双酶切、PCR鉴定、测序均表明重组载体构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约52×103,主要以包涵体的形式表达,经免疫动物制备得到多克隆抗体,ELISA检测效价达1:32000,Western Blotting显示在目的蛋白位置处有特异性阳性条带。经过LipL32蛋白作用的ECV304细胞LDH、NO释放量和对照组比较有明显升高。结论成功构建LipL32基因重组质粒,该质粒能在大肠杆菌中表达,表达的目的蛋白对细胞有一定的毒性效应。
- 黄毕鲍朗钟琪商正玲张会东王中平
- 关键词：钩端螺旋体外膜蛋白LIPL32细胞毒性
- 赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因的克隆分析及蛋白表达被引量：7
- 2006年
- 目的分析赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22的结构特征,并对其进行克隆表达。方法分别以问号状赖型钩体017株、56601株及双曲状钩体PatocI株基因组为模板PCR扩增目的基因。构建Loa22基因与质粒pGEX-4T-1的重组原核表达质粒,克隆筛选并测序。利用Bioedit、Dnaman、PSIPRED、NCBI及SignaIP等对其结构进行分析。最后在大肠杆菌JM109中诱导表达目的蛋白。结果不同毒力赖型钩体均能扩增出约600bp的片段,而PatocI株则未能扩增出目的片段;PCR、双酶切及测序证实pGEX-Loa22构建成功:分析显示不同赖型钩体的Loa22的同源性很高,C末端都具有同OmpA一致的保守序列及肽聚糖相关基序,都有信号肽序列;表达产物经SDS-PAGE检测证明是目的蛋白。结论赖型钩体具有编码OmpA膜蛋白的Loa22基因,可能与赖型钩体毒力和免疫原性存在某种相关性。
- 朱海龙鲍朗张会东王晓樱李岩
- 关键词：钩端螺旋体克隆
- 赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究
- 2008年
- 目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32。脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Westernblot检测目的基因的表达。结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达。结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据。
- 黄毕鲍朗钟琪商正玲张会东张英
- 关键词：钩端螺旋体真核表达
- 赖型钩端螺旋体溶血素HlyX基因的克隆、表达及其细胞毒效应被引量：2
- 2008年
- 目的:克隆、表达HlyX基因并研究其细胞毒性效应。方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒,转化E.coliJM109,诱导表达HlyX;将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western blotting鉴定其免疫原性;将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞,通过检测ECV304细胞乳酸脱氢酶(LDH)和一氧化氮(NO)的释放量研究目的蛋白的细胞毒性效应。结果:扩增出1179bp的目的基因HlyX,重组质粒经双酶切、PCR鉴定,测序结果表明重组质粒构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白约64kD,主要以包涵体的形式表达,经免疫动物得到多克隆抗体,ELISA检测效价达1∶64000;Western blotting鉴定在目的蛋白的位置处有特异性阳性条带。经过HlyX融合蛋白作用的ECV304细胞LDH和NO释放量明显高于对照组(P<0.01)。结论:HlyX能在大肠杆菌中表达,表达的目的蛋白对细胞有毒性效应。
- 黄毕鲍朗钟琪商正玲王中平
- 关键词：钩端螺旋体属溶血素类细胞毒性
- 大肠杆菌-钩端螺旋体重组穿梭质粒pGKINVA的构建及重组钩体的筛选
- 2007年
- 目的构建大肠杆菌-钩体穿梭质粒pGK INVA,并重组于钩体PatocⅠ株,为进一步确定钩体invA基因的功能奠定基础。方法将invA基因克隆于pGK b le24载体,PCR、限制性内切酶双酶切及测序鉴定重组穿梭质粒pGK INVA。质粒pGK INVA经电穿孔法转化无毒钩体PatocⅠ株,并筛选重组钩体菌株。结果从钩体基因组中克隆出长558 bp的invA基因,定向插入pGK b le24构建重组穿梭质粒pGK INVA,抗生素及蓝/白斑筛选和测序鉴定并获得正确的重组质粒后,电穿孔法转化钩体PatocⅠ株,在K orthof固体培养基生长并抗生素筛选、PCR鉴定出重组钩体菌株。结论成功构建重组大肠杆菌-钩端螺旋体穿梭质粒pGK INVA,并筛选出2个重组钩体菌株,将有助于进一步阐明invA基因在钩体体内中的功能分析。
- 朱庆平鲍朗张会东赵明才
- 关键词：钩端螺旋体
