安徽省高校省级自然科学研究项目(2006kj371B)
- 作品数：3 被引量：6H指数：2
- 相关作者：李俊张吕钊鲁云霞孙玉诚徐元宏更多>>
- 相关机构：安徽医科大学安徽医科大学第一附属医院更多>>
- 发文基金：安徽省高校省级自然科学研究项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 重组人PTP1B的原核高效表达及TFLC的体外抑制剂实验被引量：3
- 2009年
- 目的高效诱导表达并纯化具有活性的重组PTP1B融合蛋白(rhPTP1B),进行酶活性及抑制剂的实验。方法重组体pGEX-hPTP1B转化E.coliDH5α,诱导表达rhPTP1B并优化条件后,超声取细胞裂解上清液经GST亲和层析柱纯化后,利用rhPTP1B水解特异性底物4-硝基苯基磷酸二钠盐(pNPP-Na2)的磷酸基团而产生颜色反应来测定rhPTP1B活性,并分析其与rhPTP1B浓度、底物浓度及反应温度的关系,钒酸钠(Na3VO4)抑制类型的研究,老鹰茶总黄酮(TFLC)对rhPTP1B的抑制性作用和浓度依赖关系。结果rhPTP1B表达的最适条件是在34℃和2.0mmol/LIPTG下诱导表达10h,可被GST亲和层析法分离纯化;其活性随酶浓度及底物浓度的增加而增加,35℃时rhPTP1B的活性最大;钒酸钠的作用机制可能为非竞争性抑制作用;TFLC对rhPTP1B有明显的抑制作用。结论诱导表达纯化的rhPTP1B融合蛋白可用于抑制剂的研究,TFLC对rhPTP1B的强抑制作用可能是其降低糖尿病大鼠血糖浓度的机制之一。
- 鲁云霞孙玉秀汪凌云张吕钊李丹丹李俊
- 关键词：胰岛素
- 人PTP1B基因cDNA全长的克隆和原核系统表达被引量：4
- 2008年
- 目的构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因cD-NA全长的原核表达质粒(pET-28a(+)-hPTP1B)并在大肠杆菌中高效表达。方法取2型糖尿病人(BMI>28kg.m-2)的淋巴细胞提取总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收构建克隆载体pMD-hPTP1B,测序后设计带酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ的引物,PCR后酶切连入pET-28a(+)中,转化DE3,IPTG诱导表达,SDS-PAGE后用Westernblot检测其特异表达,并进一步对rhPTP1B诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化。结果测序证实所得的hPTP1BcDNA序列与其在GenBank中的序列一致,重组质粒pET-28a(+)-hPTP1B的双酶切结果与预期大小完全一致,IPTG诱导后高效表达的蛋白质是其不溶性的包涵体形式。IPTG诱导的最佳浓度是0.05mmol.L-1,时间为5h,温度为37℃。结论成功克隆了人PTP1B基因,构建了相应的原核表达载体并对原核体系诱导表达的条件进行了优化,使其能在DE3中高效表达,为筛选高特异的小分子抑制剂和制备相应的单克隆抗体打下坚实的基础。
- 鲁云霞李俊章秋徐元宏陈兵张吕钊孙玉诚
- 关键词：蛋白酪氨酸磷酸酶1BCDNA包涵体
- 人PTP1B真核载体在COS-7细胞中的表达及其体外抑制剂实验被引量：1
- 2007年
- 目的构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B并在猴肾成纤维细胞COS-7中稳定表达,分离纯化表达的重组融合蛋白,进行酶活性测定及抑制剂的初步实验。方法应用RT-PCR从2型糖尿病患者的外周血总RNA中扩增出PTP1BcDNA全长序列,并在基因上下游分别引入BamHⅠ、EcoRⅠ两个酶切位点,酶切后定向导入pcDNA3.1/Hismyc-B多克隆位点,构建真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B,转染COS-7细胞,G-418筛选2周后取细胞裂解上清液经Ni2+亲和层析柱纯化后,测定了其酶活性及小分子抑制剂钒酸钠的IC50。结果从2型糖尿病患者外周血中扩增得到1301bpPTP1BcDNA全长序列,经双酶切鉴定及测序分析,表明hPTP1B已克隆到pcD-NA3.1/Hismyc-B中。RT-PCR和免疫印迹表明转染成功。酶活性实验初步显示rhPTP1B的活性随酶浓度增加而增加,随PTP1B的特异性抑制剂钒酸钠的浓度增加而减少。结论获得具有酶活性的融合蛋白rhPTP1B,为进一步筛选其特异性抑制剂奠定基础。
- 张吕钊鲁云霞李俊
- 关键词：COS细胞基因表达
