国家自然科学基金(30672132)
- 作品数：10 被引量：50H指数：5
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- JNK/SAPK和p38信号转导通路在高渗透压介导的兔髓核细胞凋亡中的作用被引量：7
- 2012年
- 目的观察高渗透压对兔髓核细胞活性的影响及JNK/SAPK(c-Jun N-terminal kinases/stress-activated protein kinases)和p38信号转导通路在此过程中的作用。方法根据不同渗透压及时间段处理髓核细胞将实验分为对照组、刺激组和阻断组后采用流式细胞仪检测各组髓核细胞凋亡情况,同时利用免疫荧光和Western blot技术检测磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(phospho-p38mitogen-activated protein kinases,P-p38MAPK)、磷酸化JNK/SAPK激酶(phospho-JNK/SAPK,P-JNK/SAPK)的亚细胞定位及表达水平,观察其对髓核细胞凋亡的影响。结果高渗透压[600mOsm/kg H2O(mOsm)]可导致髓核细胞显著凋亡及P-p38 MAPK和P-JNK/SAPK蛋白表达水平改变。600mOsm时各刺激组凋亡细胞与对照组相比,差异均有显著统计学意义(P<0.01),而阻断组凋亡细胞明显减少;而400mOsm时各刺激组和阻断组凋亡细胞与对照组相比差异均无统计学意义;免疫荧光结果显示P-p38 MAPK和P-JNK/SAPK在髓核细胞质和细胞核中均有表达;经高渗透压(600mOsm)刺激后P-p38MAPK和P-JNK/SAPK表达均显著高于对照组(P<0.01),而相应阻断组P-p38MAPK和P-JNK/SAPK表达均显著降低。结论高渗透压通过激活JNK/SAPK和p38信号转导通路导致体外培养的兔髓核细胞凋亡,同时髓核细胞对轻度的渗透压升高具有一定的适应性。
- 李方辉薛少青修焕娟李桂枝王德春
- 关键词：信号转导通路渗透压JNK/SAPK细胞凋亡
- 高渗应激下ERK信号转导通路在兔髓核细胞凋亡中的作用被引量：4
- 2012年
- [目的]观察高渗透压对体外培养的兔髓核细胞凋亡的影响及细胞外信号调节激酶(ERK1/2)信号转导通路在此过程中的作用。[方法]用不同的渗透压梯度以及ERK1/2特异性抑制剂PD 98 059(50μmol/L)分不同作用时间处理髓核细胞;流式细胞仪检测髓核细胞在不同处理组的凋亡情况,蛋白质免疫印迹技术检测各组ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表达情况;免疫荧光标记技术检测p-ERK1/2蛋白在髓核细胞内的分布情况。[结果]高渗透压(600 mOsm)培养基中兔髓核细胞凋亡显著增加,与对照组相比差异有统计学意义(P=0.013),并呈时间依赖性;PD98059预处理组与相应时间段同渗透压组相比,细胞凋亡进一步显著地增加(P=0.035);400 mOsm组及其抑制组在各时间段细胞凋亡均不明显;600 mOsm高渗透压显著激活p-ERK1/2的表达,并且在3 h组表达水平最高,与对照组比较差异显著(P=0.027),而PD98059几乎阻断p-ERK1/2的表达;免疫荧光标记检测到p-ERK1/2在600 mOsm高渗组的细胞胞浆和胞核中均有分布。[结论]高渗透压(600 mOsm)应激下兔髓核细胞凋亡显著增加,而且激活的ERK1/2信号转导通路具有抵抗髓核细胞凋亡的作用;并且髓核细胞能够适应轻度增加的渗透压(400mOsm)环境。
- 刘瑞龙薛少青纪学尚周传利王德春
- 关键词：细胞凋亡
- 兔退变椎间盘体内转染hTGF－β1、β3的生物学效应被引量：3
- 2011年
- 目的 应用重组腺相关病毒2（recombinant adeno-associated virus,rAAV2）介导人转化生长因子β1（human transforming growth factor-β1,hTGF-β1）和β3（hTGF-β3）单基因或双基因联合体内转染退变兔髓核细胞,观察基因产物的表达及其对基质成分蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成的生物调节作用.方法 36只新西兰大白兔注射纤维结合素片段（fibronectin fragment,Fn-f）制造椎间盘退变模型.造模成功后,随机分为5组：实验A组8只,造模椎间盘髓核内注射rAAV2-hTGF-β1;实验B组6只,注射rAAV2-hTGF-β3;实验C组6只,联合注射rAAV2-hTGF-β1和rAAV2-hTGF-β3;实验对照D组8只,注射rAAV2介导的增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）;空白对照E组8只,髓核内注射PBS.1周后处死A组及E组中各2只兔,收获髓核组织,制作冰冻切片,免疫组化法观察hTGF-β1的表达;基因转导后4、8、12周每组处死2只兔取髓核组织组织培养和裂解,35S整合分析法检测新合成蛋白多糖的含量,免疫印迹法检测髓核Ⅱ型胶原的含量.术后12周时处死D组剩余的2只兔,观察EGFP的表达.结果 （1）术后1周,免疫组化染色显示A组髓核组织切片中髓核细胞内及细胞间hTGF-β1阳性表达较E组显著增多,基因产物大量有效表达;（2）术后4、8、12周实验A组、B组、C组基因转染后蛋白多糖表达较E组提高1.28～2.06倍,Ⅱ型胶原表达提高1.25～1.73倍,差异均有统计学意义;C组蛋白多糖表达较A组、B组提高1.195～1.290倍,Ⅱ型胶原表达较A组、B组提高1.152～1.219倍,差异有统计学意义;A组、B组间或D组、E组间蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达差异均无统计学意义;（4）术后12周,D组髓核细胞胞质内及细胞间质中观察到大量绿色荧光,基因产物EGFP仍有大量表达.结论 AAV作为新型基因转导载体可以有效介导治疗基因体内转染兔退变的髓核细胞,基因转染1周目的 基因即大量表达且持续表达超过12�
- 刘海飞宁斌王德春胡有谷
- 关键词：椎间盘转化生长因子B转染基因疗法
- 白介素6对人髓核细胞凋亡的影响被引量：10
- 2010年
- [目的]研究炎症因子IL-6对人髓核细胞凋亡的影响及可能机制。[方法]培养人髓核细胞,将细胞随即分为4组:IL-6刺激组;IL-6+P38MAPK阻断组;IL-6+JNK/SAPK阻断组及对照组。然后用AnnexinV/PI染色流式细胞仪和TUNEL法检测髓核细胞凋亡情况,免疫荧光检测P-P38MAPK和P-JNK/SAPK的表达及定位;West-ern印迹法检测P38MAPK、JNK/SAPK及各自活化形式,即P-P38MAPK和P-JNK/SAPK的表达。[结果]流式细胞仪和TUNEL法检测凋亡结果中,IL-6刺激组相对于对照组及各阻断组有着较高的凋亡细胞密度(P<0.01);免疫荧光结果显示IL-6刺激组P-P38MAPK和P-JNK/SAPK在细胞质和细胞核均有表达,各阻断组在细胞质和细胞核可见少量表达,与IL-6刺激组差异有显著统计学意义(P<0.01),对照组仅见极少量表达;Western印迹法结果显示P38MAPK,JNK/SAPK在各组髓核细胞内均有表达,但无活化形式,IL-6刺激组可见P-P38MAPK,P-JNK/SAPK表达,但相应阻断组无表达。[结论]外源性IL-6可通过P38MAPK和P-JNK/SAPK途径导致人髓核细胞凋亡。
- 董振辉王德春
- 关键词：信号传导P38MAPKJNK/SAPK细胞凋亡
- 肿瘤坏死因子α诱导人髓核细胞凋亡的作用途径被引量：14
- 2010年
- 背景:在与细胞凋亡有关的众多因素中,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成员发挥了重要的作用。但TNF是通过何种途径诱导椎间盘髓核细胞凋亡的机制尚未阐明。目的:探讨TNF-α激活后,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号转导通路中P38MAPK和应激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase,JNK/SAPK)两条途径对人髓核细胞凋亡的作用。方法:体外培养人髓核细胞,将细胞随机分成4组:TNF-α刺激组,P38MAPK阻断组,P-JNK/SAPK阻断组和对照组。采用TUNEL法检测髓核细胞凋亡情况,免疫荧光法检测P-P38MAPK和P-JNK/SAPK的表达及定位;Western Blot法检测P38MAPK,JNK/SAPK及其磷酸化形式的表达。结果与结论:TUNEL法检测凋亡结果中,TNF-α刺激组较其他各组的凋亡细胞密度大(P<0.01);免疫荧光结果显示TNF-α刺激组P-P38MAPK和JNK/SAPK在细胞质和细胞核的表达高于各阻断组和对照组(P<0.01);Western Blot结果显示P38MAPK,P-JNK/SAPK在各组髓核细胞内均有表达,但无活化形式,TNF-α刺激组可见P-P38MAPK,P-JNK/SAPK表达,但相应阻断组无表达。结果表明,外源性TNF-α可通过P38MAPK和P-JNK/SAPK途径导致人髓核细胞凋亡。
- 董振辉王德春
- 关键词：信号传导肿瘤坏死因子ΑP38丝裂原活化蛋白激酶细胞凋亡
- 应用纤维结合素建立新型兔腰椎间盘退变模型被引量：10
- 2013年
- 目的应用兔椎间盘内显微注射纤维结合素片段（Fn-f）的方法建立新型动物椎间盘退变模型。方法34只新西兰大白兔随机分为3组：实验组（16只），L1-2L2-3，L3-4，L4-5，椎间盘髓核内显微注射30kDa的Fn-f25μl；对照组（16只）相应髓核内注射磷酸盐缓冲液（PBS）25汕l；空白组（2只）不做处理。术后4、8、12周处死实验组及对照组各4只兔，对髓核组织切片行番红O染色和HE染色，采用^35S整合分析法检测髓核蛋白多糖合成。实验组和对照组中各取4只兔分别于术前及术后4、8、12和16周行腰椎数字化x射线摄影（DR）检查，测量计算椎间盘高度指数（DHI），术后16周处死，行番红O染色、HE染色和蛋白多糖合成测定。空白组2只兔处死后检测髓核蛋白多糖合成。结果实验组兔椎间盘髓核细胞数目进行性减少，内层纤维环结构紊乱、破坏；髓核区4周后出现进行性缩小，术后16周髓核区消失，与内层纤维环组织不能分辨。实验组兔椎间盘蛋白多糖合成率进行性下降（F=263．241，P=0．000）；术后各时间点，实验组兔椎间盘蛋白多糖合成率均较对照组显著降低（t=-27．010～-2．833，P〈0．05）。术后8周DR示造模椎间隙开始出现明显狭窄，进行性加重，12周时椎间盘及临近椎体前方出现骨赘，16周时骨赘增生明显。术后4周，实验组与对照组DHI百分比（DHI％）分别为96．5％±1．7％和97．4％±1．2％，差异无统计学意义（P〉0．05）；术后8、12和16周，实验组DHI％分别为85．6％±3．8％、77．2％±3．5％和65．5％±5．6％，均较对照组明显减低（t=-21．225～-10．795，P〈0．01）。结论显微注射Fn-f可使兔腰椎间盘发生缓慢的、进行性的、与人椎间盘自然退变过程相似的退变，具有较好的模拟性和重复性，为椎间盘退变分子水平的研究提供了一种新型的、实用的动物模型。
- 刘海飞张晗乔光曦陶昊陈峰扈延龄王德春胡有谷
- 关键词：疾病模型动物腰椎椎间盘纤维结合素
- 微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞增殖及生长动力学研究
- 2012年
- [目的]通过单层培养和微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞对比,研究两种培养方式对其生长活性及增殖能力的影响。[方法]本实验通过Trypan blue法计数细胞并绘制生长曲线,应用3H-TdR放射免疫法检测退变髓核细胞增殖活性,流式细胞仪检测退变髓核细胞周期,比较两种培养方式对细胞增殖的影响。[结果]微载体旋转立体旋转培养较单层培养细胞从贴壁到对数生长期开始时间(16～20 d)较长,但是严格意义的稳定生长期(3～5 d)很短;对数生长期长,一般14～17 d,期间细胞增殖活跃。两种培养方式的细胞处于稳定生长期时,细胞增殖能力没有明显区别,而处于对数生长期时,微载体培养的细胞的增殖能力明显高于单层培养组的细胞(P<0.05)。细胞周期测定显示两种细胞停滞在G0/G1期的占71%左右,培养方式对其影响不明显。而微载体培养的细胞的S期明显较单层培养的细胞为长(P<0.05)。[结论]成人退变髓核应用微载体培养后增殖能力及生长活性提高,可解决组织工程学椎间盘种子细胞难以收集的难题,为将来开展椎间盘组织工程学的研究奠定良好的基础。
- 宁斌刘海飞龚维明田庆芬王德春胡有谷
- 关键词：微载体髓核细胞细胞周期
- 成人退变髓核细胞微载体旋转立体培养对细胞外基质合成的影响被引量：2
- 2013年
- 目的探讨成人退变髓核细胞的体外微载体旋转立体培养模式及其对细胞外基质合成的影响。方法标本取自2005年9月至2009年5月因椎间盘疾患而施行椎体间融合术的患者，对总共34个退变的髓核组织进行体外培养，将其随机分为单层培养组和微载体旋转立体培养组。对2种培养方式的对数生长期髓核细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原的SP-ABC免疫组化法染色，并行Ⅰ、Ⅱ型胶原的Wester nblot定量检测；用”S标记放射免疫定量分别检测两组处于不同生长期细胞的蛋白多糖含量，数据采用两独立样本的t检验进行统计分析。结果Ⅰ、Ⅱ型胶原的SP-ABC免疫组化法和Westernblot定量检测均显示微载体培养组高于单层培养组。SP-ABC免疫组化法结果：Ⅰ型胶原：32．5±4．4比15．2-4±1．2，t=2．871，P〈0．01；Ⅱ型胶原：43．6±4．1比23．1±2．2，t=2．375，P〈0．05；Westernblot定量检测结果：Ⅰ型胶原：0．62±0．08比0．504-0．06，t=3．327，P〈0．01；Ⅱ型胶原：1．464-0．08比0．86±0．04，t=2．453，P〈0．05。^35S标记放射免疫显示两种生长期的髓核细胞，微载体培养组表达蛋白多糖的含量均高于单层培养组（稳定生长期：348214±312比21046±673，t=2．134，P〈0．05；对数生长期：451344±175比321934±713，t=2．801，P〈0．01）。结论微载体旋转立体培养法对成人退变髓核细胞基质内Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达具有正向调控的作用，可以适用于成人退变髓核细胞的大量扩增。
- 宁斌刘海飞龚维明赵凯杜红霞刘勇王德春胡有谷
- 关键词：椎间盘细胞外基质微球体胶原蛋白聚糖类
- 氧化应激对大鼠髓核细胞凋亡的影响被引量：11
- 2009年
- 背景:细胞凋亡在椎间盘退变过程中发挥重要作用,而导致细胞凋亡的因素很多,氧化应激是导致细胞凋亡的一个重要因素。目的:从细胞内信号转导水平验证过氧化氢对大鼠髓核细胞氧化应激损伤的影响。设计、时间及地点:单一样本观察,试验于2008-03/10在山东省创伤骨科研究所完成。材料:p38MAPK特异性阻断剂(SB203580)、JNK特异性阻断剂(SP600125)购自碧云天生物技术有限公司;大鼠椎间盘来自2只新生24h SD大鼠。方法:原代培养大鼠髓核细胞,将生长良好的髓核细胞制成细胞悬液,随即分为4组:H202组:用0,50,100,200,400,800μmol/L H2O2刺激;对照组:不加刺激的细胞;SB203580+H2O2组:给予特异性p38MAPK阻断剂SB203580预孵育细胞,再给予H2O2刺激;SP600125+H2O2组:给予特异性JNK阻断剂SP600125预孵育细胞,再给予H2O2刺激。上述处理后检测相关指标。主要观察指标:以免疫组织化学检测P-p38和P-JNK的表达情况及表达位置;Western印迹法检测SAPK/JNK、p38MAPK及其磷酸化组分的表达。结果:H2O2能够激活髓核细胞内p38和JNK的活性;SB203580能够有效地抑制p38MAPK的活性,而SP600125则能够有效的抑制JNK的活性;免疫荧光显示P-p38MAPK和P-JNK在细胞质和细胞核均有表达中,而对照组未发现。结论:大鼠髓核细胞受氧化应激后可通过p38MAPK和JNK通路导致细胞凋亡。
- 李洪涛王德春魏见伟
- 关键词：髓核细胞信号传导P38MAPKJNK细胞凋亡
- 微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞及鉴定
- 2013年
- 背景:旋转生物反应器是目前应用较多的微载体培养系统。目的:应用微载体旋转立体培养方法对成人退变髓核细胞进行扩增及鉴定。方法:对手术切除的髓核组织进行原代培养,传代后进行单层培养和微载体旋转立体培养的对比,并行苏木精-伊红、Gimsa染色观察细胞形态,利用电镜观察其超微结构,利用MTT比色法检测细胞生长活性。结果与结论:倒置相差显微镜观察培养的细胞符合退变髓核细胞形态,透射电镜下可显示其退变改变。倒置相差显微镜和扫描电镜下观察,可见退变的髓核细胞呈立体状生长,并能够成功甩珠传代。细胞在对数生长期时,微载体培养的细胞的生长活性明显高于单层培养组的细胞。表明微载体旋转立体培养法可以较好的维持细胞表型,对对数生长期髓核细胞的细胞活性具有明显的刺激作用。
- 宁斌丁远景龚维明刘海飞刘勇王德春胡有谷
- 关键词：髓核细胞退变微载体细胞培养细胞鉴定
