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大黄鱼病原哈维氏弧菌单克隆抗体的制备及其应用被引量：6: 2009年; 用甲醛灭活哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)GYC1108-1制备免疫原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对杂交瘤进行筛选,阳性克隆经2—3次亚克隆后,共获得5株针对GYC1108-1的单克隆抗体。选取1B7制备小鼠腹水抗体,其细胞上清及腹水效价分别为1∶3200和1∶32000。同样用灭活的哈维氏弧菌免疫新西兰大白兔,5次免疫后颈动脉采血,离心取血清,并用饱和硫酸铵法进行纯化,制备了兔抗哈维氏弧菌多克隆抗体,其ELISA效价为1∶51200。利用1B7单克隆抗体和兔抗哈维氏弧菌多克隆抗体以及山羊抗小鼠HRP酶标二抗,建立了检测哈维氏弧菌的三抗体夹心酶联免疫吸附试验(TAS-ELISA)方法。该方法对哈维氏弧菌的最小检出浓度为1×104个/mL。用该TAS-ELISA方法检测大黄鱼(Pseudosciaena crocea)样品,54尾患病大黄鱼中有45尾检出哈维氏弧菌,而14尾健康大黄鱼都没有检出哈维氏弧菌。由此可见,本试验建立的TAS-ELISA方法,可以用于患病大黄鱼哈维氏弧菌的快速诊断。; 郝贵杰沈锦玉徐洋姚嘉赟潘晓艺尹文林; 关键词：大黄鱼哈维氏弧菌单克隆抗体

水生动物的弧菌病及其致病机理被引量：15: 2006年; 概述了国内外发现的主要致病弧菌及其致病机理。从黏附作用、脂多糖、溶血素、外膜蛋白和胞外蛋白酶等方面阐述了弧菌的致病机理及其研究现状,并展望了今后的研究方向。; 潘晓艺沈锦玉尹文林曹铮; 关键词：弧菌弧菌病致病机理致病因子

抗哈维氏弧菌脂多糖单克隆抗体的制备及其鉴定被引量：10: 2008年; 以哈维氏弧菌GYC1108-1细菌颗粒性抗原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,5次免疫后取其脾细胞与SP2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合。用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对杂交瘤进行筛选,阳性克隆经3次亚克隆后,获得一株针对GYC1108-1脂多糖(LPS)的特异性单克隆抗体,命名为2 F 9。该株单抗细胞培养上清ELISA效价为1∶1 600,腹水效价为6.4×104,交叉反应结果表明2 F 9除了与测试的多株哈维氏弧菌发生免疫识别外,还与溶藻弧菌、麦氏弧菌和副溶血弧菌代表株发生免疫交叉反应,但不与拟态弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌代表株等发生交叉反应。用温和高碘酸氧化法对LPS处理后,GYC1108-1的LPS与2 F 9的反应部分减弱,免疫印迹结果表明2 F9识别LPS的类脂A抗原。用抑制ELISA法半定量检测GYC1108-1培养上清的LPS,测得培养48 h LPS释放量不超过39μg/mL,大大低于使鱼类致死所需的LPS的剂量。; 郝贵杰沈锦玉潘晓义曹铮尹文林; 关键词：哈维氏弧菌脂多糖间接ELISA 单克隆抗体免疫印迹

网箱养殖大黄鱼假单胞菌病病原的分离与鉴定被引量：29: 2008年; 浙江宁波、台州等地相继发生网箱养殖大黄鱼的大量死亡,主要症状为脾脏、肾脏有许多白色结节,大小为0.1～1mm。从病鱼体内分离出致病力极强的菌株GYCWS,人工感染试验证实为大黄鱼的病原菌,其半数致死量(LD50)为8.5×104CFU/ml。对该细菌进行了形态、生理生化特性的测定,并进行了全自动微生物分析系统(ID32GN)及16S rRNA分子鉴定。经PCR扩增获得了大小约1.5Kb的16S rRNA部分基因片段,产物经回收纯化,克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌TG1,对阳性克隆子进行酶切及PCR鉴定确认阳性重组质粒,将测定的序列递交NCBI进行BLAST同源序列比对,与恶臭假单胞菌的16S rRNA基因(DQ201403、AY785244)具有较高的同源性(99%),该序列在Genbank上的登录号为DQ648602。结合细菌的生理生化特性,GYCWS菌株属于恶臭假单胞菌(Pseudo monas putida)。药敏试验结果表明,病原菌GYCWS对卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那、氟派酸、四环素、链霉素药物敏感。; 沈锦玉余旭平潘晓艺许文军尹文林曹铮; 关键词：大黄鱼病原恶臭假单胞菌 RRNA

哈维氏弧菌GYC1108-1胞外蛋白酶的制备及免疫原性研究被引量：4: 2010年; 胞外蛋白酶(ECPase)是哈维氏弧菌GYC1108-1胞外产物的主要致病因子,经鉴定其为半胱氨酸蛋白酶,分子量约55kD,能够分解脱脂奶中的酪蛋白,命名为1108-ECPase。本实验建立了胞外蛋白酶活性平板法检测1108-ECPase和YZ-ECPase的相对酶活(YZ为由本实验室构建的能够分泌目的蛋白酶的重组菌),并利用这个方法确定了细菌分泌ECPase达最高峰的培养时间为36h,粗提ECPase最适的饱和硫酸铵浓度为70%。GYC1108-1和YZ培养上清经硫酸铵盐析,SephadexG-25凝胶过柱后,得到较为纯化的1108-ECPase和YZ-ECPase。选择白油、蜂胶和弗氏3种不同佐剂与适量抗原混匀,分别免疫3只ICR小鼠,并设不加佐剂免疫组及空白组作为对照。3次免疫后制备小鼠血清,间接ELISA测定抗体效价,除空白对照外,其他8组小鼠的免疫血清效价达1∶1.6×104～1∶2.56×105,免疫组的效价从高到低依次为弗氏>白油>蜂胶>不加佐剂,不同佐剂的免疫效果依次为:弗氏>白油>蜂胶。免疫印迹实验结果表明,小鼠血清在55kD处有明显的反应条带。; 郝贵杰沈锦玉潘晓艺尹文林曹铮; 关键词：哈维氏弧菌胞外蛋白酶佐剂间接ELISA 免疫印迹

哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的克隆表达及免疫原性被引量：3: 2010年; 根据实验室分离的大黄鱼弧菌病主要病原菌哈维氏弧菌(Vib rio harveyi)GYC1108-1株的胞外蛋白酶基因序列,设计胞外蛋白酶基因(ΔProA)特异性引物,扩增获得1552bp的ΔProA基因,克隆于pUC57-T载体;将ΔProA基因亚克隆到原核表达载体pET-28a进行融合表达,SDS-PAGE电泳检测发现,ΔProA融合蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达,分子量大小约55kD,诱导5h的表达蛋白产量约占细菌总蛋白的21%。Western blot分析,表达的55kD蛋白具有较高免疫原性。用纯化的ΔProA融合蛋白对大黄鱼进行免疫试验,结果免疫保护率达到75%。; 潘晓艺沈锦玉余旭平许文军曹铮尹文林郝贵杰; 关键词：哈维氏弧菌胞外蛋白酶原核表达包涵体大黄鱼

大黄鱼细菌性病原哈维氏弧菌培养特性的研究被引量：4: 2009年; 弧菌是危害水产养殖动物的最为严重的病原之一。从患病大黄鱼肝脏分离致病的细菌哈维氏弧菌GYC1108-1为材料,对哈维氏弧菌GYC1108-1株的最佳生长条件及培养基优化进行了测定。综合考察不同的培养温度、培养时间、培养基盐度、培养基的pH值对细菌生长的影响,并采用正交实验法,对培养基配方进行优化。结果表明:不同的培养温度、培养时间、培养基盐度、培养基pH值等均会影响细菌的产量。GYC1108-1适宜生长的盐度为1%～5%、pH为5～9.5、温度为15～35℃、在培养基中添加硫酸铜、硫酸氨会明显促进生长;最佳培养条件及培养基成份为:NaCl 2%,pH8.0,温度30℃,蛋白胨1.0%、牛肉膏0.75%、CuSO_4 0.3mg/L、(NH_4)_2SO_4 0.1g/L。; 沈锦玉潘晓艺尹文林郝贵杰曹铮; 关键词：哈维氏弧菌大黄鱼

哈维氏弧菌的主要致病因子及其特性分析被引量：17: 2011年; 从大黄鱼致病菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)GYC1108-1株提取外膜蛋白(OMP)、脂多糖(LPS)和胞外产物(ECP),并进行毒性实验,以研究哈维氏弧菌的主要致病因子及其特征.结果表明:OMP、LPS致病性较弱,而ECP可导致鱼死亡,初步得出哈维氏弧菌GYC1108-1株的主要致病因子为胞外产物,其对鱼的半数致死量(LD50)为3.5μg·g-1;该蛋白酶与底物偶氮酪蛋白(azocasein)作用的最适pH为8.0,最适温度28℃,对热敏感,分子质量为55 ku;该酶活性被碘乙酸抑制,也被SDS和HgCl2完全抑制,PMSF和ZnCl2能部分抑制该蛋白酶活性,而CuCl2、CaCl2、MgCl2对该酶活性影响不大,2-巯基乙醇、DTT、L-半胱氨酸、EDTA和EGTA对该酶活性有促进作用,表明其为半胱氨酸蛋白酶;研究发现ECP具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶和脂肪酶活性,无脲酶活性;免疫印迹结果发现GYC1108-1的ECP能与大黄鱼抗GYC1108-1血清发生免疫发应,分子质量为55 ku的半胱氨酸蛋白酶是具有免疫原性的物质.; 沈锦玉李新华潘晓艺尹文林郝贵杰; 关键词：哈维氏弧菌致病因子半胱氨酸蛋白酶免疫印迹

32种常用渔药对大黄鱼致病菌哈维氏弧菌的体外抗菌试验被引量：12: 2008年; 采用试管二倍稀释法测定了32种常用渔药对本实验室分离鉴定的一株大黄鱼致病菌-哈维氏弧菌GYC1108-1的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。其中中草药7种,抗菌药8种,常用水体消毒剂17种。结果显示,7种中草药对受试菌GYC1108-1的MIC介于0.039～625 mg/L,MBC介于0.078～1 250 mg/L;8种抗菌药对该菌的MIC介于0.078～1.25mg/L,MBC介于0.156～2.5 mg/L;17种水体消毒剂对该菌的MIC介于0.062～3.125 mg/L,MBC介于0.078～6.25 mg/L。试验表明,这些渔药都对哈维氏弧菌有较好的抗菌效果。; 郝贵杰沈锦玉潘晓义尹文林; 关键词：渔药哈维氏弧菌最小抑菌浓度最小杀菌浓度体外

抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其特性鉴定被引量：8: 2007年; 目的:研制抗哈维氏弧菌特异性单克隆抗体(mAb)并进行免疫学特性分析。方法:以哈维氏弧菌GYC1108-1颗粒性抗原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,5次免疫后取其脾细胞与Sp2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合。用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对杂交瘤进行筛选,并鉴定mAb特异性及敏感性。结果:各株阳性克隆经3次亚克隆后,共获得5株抗GYC1108-1的mAb,其中1B7的细胞上清及腹水效价分别为1∶3 200和1∶32 000,交叉反应结果表明1B7除了与测试的多株哈维氏弧菌发生反应外,还与溶藻弧菌、麦氏弧菌和副溶血弧菌发生免疫交叉反应,但不与拟态弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌等发生交叉反应。ELISA检测1B7腹水对GYC1108-1的敏感性达107/L。结论:制备的抗哈维氏弧菌mAb可为哈维氏弧菌的检测及防治等提供有用的试剂。; 郝贵杰沈锦玉曹铮潘晓义; 关键词：哈维氏弧菌间接ELISA 单克隆抗体

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浙江省科技厅重点资助项目(2005F12005)

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