国家自然科学基金(81160206)
- 作品数：23 被引量：41H指数：7
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- 猪带绦虫重组Bb—TS045W-4B—TSOL18疫苗诱导仔猪的保护性免疫应答被引量：4
- 2015年
- 目的探讨猪带绦虫重组Bb．TS045W-4B．TSOL18疫苗免疫仔猪后，对猪带绦虫卵攻击感染后的保护性免疫应答。方法将20头40日龄健康仔猪按体质量（约15kg）采用随机数字表法分为5组，每组4头。分别为重组b-TS045W．4B—TSOL18疫苗灌胃组、重组Bb—TS045W-4B疫苗灌胃组、重组Bb-TSOLl8疫苗灌胃组、空载体对照组和双歧杆菌液体培养基（MRS）对照组。各疫苗的免疫剂量为1×10“菌落形成单位（CFU），间隔2周免疫1次，共免疫2次。于末次免疫仔猪4周后，各组仔猪用猪带绦虫卵攻击感染，攻击感染后3个月剖杀仔猪，分离猪囊尾蚴，计算减蚴率；前腔静脉取血，分离血清和制备外周血淋巴细胞（PBMC）。酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测血清免疫球蛋白（Ig）G、IgGl、lgG2a水平和PBMC培养上清液中白细胞介素（IL）．2、干扰素（IFN）．1、IL4及IL-10水平；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测PBMC增殖情况。结果猪带绦虫重组Bb．TS045W．4B．TSOLl8、重组Bb—TS045W．4B、重组Bb—TSOLl8疫苗灌胃组减蚴率分别为83．09％、71.36％和74．85％。仔猪血清IgG、IgGl和IgG2a水平组间比较差异均有统计学意义（F=132．348、106．336、596．091，P〈0．05）。其中重组Bb-TS045W-4B-TSOL18、重组Bb-TS045W-4B、重组Bb．TSOL18疫苗灌胃组IgG、IgG2a水平[（366．81±3．84）、（334．94±11．65）、（333．52±11．09），（87．74±0．95）、（84．48±0．80）、（84．30±1．09）mg／L]均高于MRS对照组[（245．94±8．81）、（62．61±0．84）mg／L，P均〈0．05]，IgGl水平[（26．55±1．06）、（33．24±1．92）、（32．60±1．94）mg／L]低于MRS对照组[（42．78±0．87）mg／L，P均〈0．05]。仔猪PBMC培养上清原液中IL-2、IFN-1、IL．4和IL．10水平组间比较差异均有统计学意义（F=139．522、1053．102、769．097、962．298，P均〈0．05）。其中重组Bb．TS045W．4B．T
- 贾启刘美辰周泠杨凤娇江楠王灵军周必英
- 关键词：猪带绦虫保护性免疫应答仔猪
- 猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗不同保存条件下的稳定性研究被引量：4
- 2015年
- 目的研究猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组双歧杆菌(Bb)疫苗在不同保存条件下的稳定性。方法分别将猪带绦虫重组质粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4BTSOL18电转入长双歧杆菌(B.longum),获得阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEXTSO45W-4B-TSOL18/B.longum,分别置于不同条件下保存,取出菌液,抽提质粒,电泳检测,进行稳定性分析。结果阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum分别在常温下、4℃、-20℃、-80℃、-196℃(液氮中)分别保存48h、1周、1月、2月,抽提质粒,电泳发现阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum在液氮中、-80℃、-20℃中比较稳定,而在普通的室温环境下,很快发生质粒丢失现象。结论猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组Bb疫苗低温保存最稳定,常温最差,这为猪带绦虫重组Bb疫苗的进一步研究奠定了基础。
- 周必英刘美辰杨凤娇
- 关键词：猪带绦虫稳定性
- 猪带绦虫TSO45W-4B基因在长双歧杆菌中的表达被引量：1
- 2015年
- 目的:在成功构建猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒p GEX-TSO45W-4B的基础上,研究猪带绦虫TSO45W-4B基因在长双歧杆菌中的表达情况。方法:将猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒p GEX-TSO45W-4B电转化入长双歧杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot分析表达情况。结果:酶切、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和测序证实,重组质粒p GEX-TSO45W-4B成功转入长双歧杆菌。SDS-PAGE显示,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为40 k D,经谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)亲和层析后可获得纯度为85%以上的重组蛋白。Western blot显示,重组蛋白能被兔抗TSO45W-4B血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别。结论:猪带绦虫TSO45W-4B基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的重组蛋白具有特异的抗原性。
- 周必英刘美辰杨凤娇
- 关键词：猪带绦虫长双歧杆菌
- 不同剂量猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗免疫家猪诱导的免疫应答动态观察被引量：3
- 2014年
- 目的动态观察不同剂量猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗免疫家猪诱导的免疫应答,确定该疫苗的合适免疫剂量。方法将16头40d龄健康家猪随机分为4组,分别以1010、1011和1012克隆形成单位（CFU）猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗经口免疫2次,间隔2周,同时设双歧杆菌液体培养基（MRS）对照组。于免疫后0、2、4、6和8周,前腔静脉取血,分离血清和制备外周血淋巴细胞（PBMC）,采用ELISA法检测免疫猪血清特异性IgG、IgG2a水平及PBMC培养上清液IL-2、IL-4水平。结果免疫猪血清特异IgG水平于免疫后4～8周升高,F值分别为1182.122、412.602、1451.071,于4周达较高水平；IgG2a于2～8周升高,F值分别为288.216、1741.82、1 352.143、201.426,于2周达较高水平。PBMC培养上清液IL-2于免疫后2～6周升高,F值分别为571.912、3 854.482、1 485.647,于4周达较高水平；IL-4于免疫后4～6周升高,F值分别为5443.863、4100.819,于4周达较高水平,与0周时及MRS对照组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）；1011 CFU免疫组血清特异IgG、IgG2a水平和PBMC培养上清液IL-2、IL-4水平与1010 CFU、1012 CFU免疫组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）,1010 CFU、1012 CFU免疫组间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 1010～1012CFU猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗灌胃免疫家猪均可诱导产生有效的免疫应答,其中以1011 CFU免疫组效果较好。
- 刘美辰江强周必英
- 关键词：猪带绦虫免疫剂量
- 3种猪带绦虫重组双歧杆菌候选疫苗在家猪体内的mRNA表达被引量：1
- 2015年
- 目的检测3种猪带绦虫重组双歧杆菌候选疫苗在家猪体内的表达情况。方法将40t3龄健康家猪分别用10n克隆形成单位（colonyformingunits，CFU）的猪带绦虫Bb．TS045W-4B、Bb．TSOL18和Bb-TS045W-4B．TSOL18重组候选疫苗对家猪口服灌胃。首次免疫2周后加强免疫1次。于首免后56d，剖杀家猪。无菌取肝、肺、脾，采用RT-PCR方法检测上述3种候选疫苗在家猪体内的mRNA表达情况。结果在家猪肝脏、肺脏和脾脏中均检测到猪带绦虫TS045W．4B基因的mRNA．其中肝脏和肺脏的相对表达量为3．3，3．3，1肝脏和肺脏的相对表达量高于脾脏；猪带绦虫TSOL18基因在家猪肝脏和脾脏中均有表达，其中肝脏相对表达量为2．6，高于脾脏的1；猪带绦虫TS045W-4B．TSOL18融合基因在肝脏、肺脏和脾脏中均有表达，相对表达量依次为0．2、2．4、2．1。结论3种猪带绦虫重组双歧杆菌候选疫苗可在家猪体内表达．有利于发挥疫苗的免疫效应。
- 周必英刘美辰杨凤娇
- 关键词：猪带绦虫家猪
- 猪带绦虫双歧杆菌表达系统pGEX-TSOL18/B.longum的构建及鉴定被引量：7
- 2014年
- 通过全基因合成猪带绦虫TSOL18基因,将该基因定向克隆至大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-TSOL18,电穿孔法将该质粒导入长双歧杆菌(Bifidobacterium longum),构建猪带绦虫双歧杆菌表达系统pGEX-TSOL18/B.longum,并通过酶切、PCR和测序鉴定。全基因合成了393 bp的TSOL18基因片段。酶切、PCR和测序鉴定结果证明猪带绦虫双歧杆菌表达系统pGEX-TSOL18/B.longum构建成功。
- 周必英刘美辰贺莉芳
- 关键词：猪带绦虫双歧杆菌TSOL18重组菌
- 猪带绦虫TS045W-4B—TSOL18融合基因在大肠埃希菌ArcticExpress（DE3）中的表达、纯化和兔抗血清的制备被引量：10
- 2013年
- 目的构建猪带绦虫pGEX—TS045W-4B-TSOL18重组质粒，纯化重组融合蛋白及制备兔抗重组蛋白血清。方法用疏水甘氨酸接头（Gly,Ser），连接TS045W-4B和TSOL18编码基因，通过全基因合成猪带绦虫TS045W-4B—TSOL18融合基因。将融合基因定向克隆到pGEX—1λT表达载体上，构建重组质粒pGEX—TS045W-4B—TSOL18，再用重组质粒转化大肠埃希菌（E．col）ArcticExpress（DE3）。用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导其表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析表达情况，亲和层析纯化获得重组融合蛋白。用纯化的重组蛋白按0．5mg／只与弗氏完全佐剂（CFA）混合，于兔后腿肌肉及背部皮下多点免疫注射；2周后再用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂（IFA）混合加强免疫，此后每隔10d按第2次免疫法重复加强免疫，第4次免疫后6d，采集兔心脏血并分离血清，立即纯化及制备抗血清。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗血清的效价，采用蛋白印迹（Western blot）法鉴定抗血清的特异性。结果全基因合成的TS045W-4B—TSOL18融合基因片段长度为789bp。酶切证实pGEX—TS045W-4B—TSOL18重组质粒成功构建，测序结果获得的基因片段大小为789bp，与预期大小相符。SDS—PAGE分析和亲和层析后显示，重组质粒在转化E．col ArcticExpress（DE3）后，获得了相对分子质量约为55×10。的重组融合蛋白，纯度为85％。EUSA测定兔抗血清的效价为1：512000，Westernblot证实抗血清能与重组融合蛋白发生特异性反应，在相对分子质量约为55×10^3处出现1条与预期大小-致的特异性条带。结论成功地构建猪带绦虫重组质粒pGEX—TS045W-4B—TSOL18及制备了高纯度的TS045W-4B—TSOL18重组融合蛋白和高滴度的兔抗重组蛋白血清。
- 周泠周必英刘美辰刘晖贺莉芳
- 关键词：猪带绦虫重组融合蛋白抗血清
- 猪带绦虫TSOL18基因在长双歧杆菌中的表达被引量：2
- 2014年
- 目的在成功构建猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSOL18的基础上,研究猪带绦虫TSOL18基因在长双歧杆菌中的表达情况。方法将猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSOL18电转化入长双歧杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达情况。结果酶切、PCR和测序证实,重组质粒pGEX-TSOL18成功转入长双歧杆菌。SDS-PAGE显示,目的蛋白相对分子质量(Mr)约为41KD,与预期结果相一致。Western blot显示,目的蛋白能被兔抗血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别。结论猪带绦虫TSOL18基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的目的蛋白具有抗原性。
- 周必英刘美辰杨凤娇
- 关键词：猪带绦虫TSOL18长双歧杆菌
- 寄生虫疫苗免疫途径的研究现状被引量：2
- 2014年
- 寄生虫病是一种呈世界性分布、种类繁多、危害严重的重要疾病.目前防治寄生虫病的方法主要是健康教育、化疗、环境改造等综合防治措施相结合,其中抗寄生虫药一直是主要的防治手段.然而,随着耐药性和人类健康等问题的出现,寄生虫疫苗的研制已成为控制寄生虫病综合防治措施的重要补充手段.用不同的方法接种寄生虫疫苗,其保护效果不尽相同.该文就几种常见的寄生虫疫苗免疫途径研究现状作一综述.
- 万小波周必英
- 关键词：寄生虫疫苗免疫途径
- 猪带绦虫重组抗原研究进展被引量：14
- 2014年
- 猪囊尾蚴病(Cysticercosis cellulosae)俗称囊虫病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium,Ts)中绦期幼虫猪囊尾蚴(cysticercus cellulosae)引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。该病呈全球性分布,主要流行于中非、南非、拉丁美洲、东亚和南亚等地区。我国主要流行于黑龙江、吉林、河南、河北、山东、广西、云南、四川和贵州等31个省市自治区。采用分子生物学技术对Ts生活史不同阶段的抗原基因进行克隆、表达及生物学功能研究是当前研究的热点。本文就Ts六钩蚴、囊尾蚴、成虫阶段重要重组抗原的研究进展作一介绍。
- 周必英
- 关键词：猪带绦虫猪囊尾蚴病重组抗原
