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国家自然科学基金(81101702)
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方琳
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刘俊杰
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表达抗G250人源性抗体增殖缺陷型腺病毒的构建
2013年
目的构建表达抗G250人源性抗体的增殖缺陷型腺病毒。方法通过重叠延伸PCR、常规PCR方法,分别获得G250重链的可变区和恒定区(GH)eDNA序列及G250轻链(GL)eDNA序列,并克隆至pCLON12-IRES载体上,构建质粒pCLON12-GL-IRES—GH。酶切质粒pCLON12-GL—IRES—GH回收GL—IRES—GH片段,克隆至腺病毒载体pDC315,构建pDC315-GL—IRES—GH(pDC315-G250)。将pDC315-G250与腺病毒包装骨架质粒pBHGE3共转染HEK293细胞,重组包装表达G250抗体的增殖缺陷型腺病毒AdDC315一G250。纯化病毒表达的G250抗体,免疫印迹实验检测该抗体能否与细胞表面抗原特异性结合。结果PCR及测序结果表明成功构建质粒pCLON12-GL—IRES—GH及腺病毒穿梭质粒pDC315-G250。PCR鉴定表明重组腺病毒AdDC315-G250含有目的基因,病毒包装成功。免疫印迹实验结果显示,纯化的抗体在G250抗原阳性的细胞中能检测到目的条带。结论成功构建表达抗G250人源性抗体的增殖缺陷型腺病毒。
方琳
程乾
李望
刘俊杰
郑骏年
关键词:
肾肿瘤
G250
抗体
重组腺病毒
表达抗G250人源性抗体腺病毒对肾癌细胞的影响
2013年
目的检测腺病毒Ad-G250表达的G250全长人源性抗体的生物学活性及其对肾癌细胞的影响。方法扩增纯化腺病毒Ad—G250、Ad—EGFP(对照病毒)。病毒感染LO-2细胞,ELISA法检测细胞培养液中抗体的表达量。收集病毒感染后的细胞上清液进行纯化,Westernblotting检测纯化抗体的相对分子质量及其与细胞表面G250抗原的结合能力。免疫组化法检测Ad—G250表达的抗体是否具有生物学活性。CCK-8法检测Ad—G250对肾癌Ketr-3及ACHN细胞增殖的影响。AnnexinV—PE/7-AAD法检测Ad—G250对‘肾癌Ketr-3及ACHN细胞凋亡的影响。结果病毒Ad—G250感染LO-2细胞后G250抗体的表达量随着感染天数的增加而增加。Westernblotting实验显示Ad—G250能够表达G250抗体的轻链和重链,电泳图上该抗体能使G250抗原阳性的Ketr-3和786-O细胞在相对分子质量58×10’附近出现反应条带,而G250抗原阴性的ACHN和HK-2细胞在相应位置无反应条带。细胞免疫组化实验显示Ketr-3细胞膜被染成棕黄色,而ACHN细胞未见着色。CCK-8实验结果显示,Ad—G250对Ketr-3细胞有抑制作用,而对ACHN细胞的抑制作用不明显;Ad—G250抑制Ketr-3细胞增殖存在浓度及时问依赖性。凋亡实验显示,Ad—G250诱导Ketr-3细胞凋亡作用和ACHN细胞相比差异具有统计学意义,Ad—G250诱导Kert-3凋亡作用和Ad—EGFP相比差异有统计学意义。结论腺病毒Ad—G250成功表达出具有生物学活性的人源性G250抗体,且Ad—G250可抑制表达G250抗原的肾癌细胞增殖,诱导其凋亡。
方琳
程乾
李望
刘俊杰
郑骏年
关键词:
G250
放射免疫显像
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