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高通量筛选技术在动物生物制品研究中的应用被引量：2: 2011年; 高通量筛选技术是以分子水平和细胞水平为基础,以微板形式作为工具,通过自动化操作系统高效地大量检测样品和处理试验数据,并根据结果从数以千万计的样品中筛选出目标样本的一种技术体系,它具有微量、快速、灵敏和准确等特点。这一高新技术近年来在药物筛选领域的广泛应用使得新药开发进入了一个新的时期。而在动物生物制品研究领域,高通量筛选技术已开始得到初步的应用和发展,这也大大加快了各类动物生物制品,特别是新型动物疫苗研制的步伐。本文通过对高通量筛选技术的实际应用进行综述,充分显示了这一技术在动物生物制品研究领域具有广阔的应用前景。; 梅建国庄金秋李峰赵蕾沈志强; 关键词：高通量筛选动物生物制品疫苗

PRRSV经典与高致病性毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立被引量：12: 2010年; 根据GenBank登录的经典与高致病性PRRSVNsp2序列,设计了1对引物,所扩增的序列包含高致病性毒株缺失部分,用于区分经典与高致病性毒株,并对扩增条件进行了优化。结果表明,应用该方法,能从经典与高致病性PRRSV基因组中分别扩增出573,483bp的特异性片段,病毒基因组混合后能够同时扩增;并可以检测出1.8TCID50/100μL经典毒株及0.6TCID50/100μL高致病毒株的病毒RNA;对CSFV,JPV,PEDV,TGEV,RV,PPV,PRV,PCV-2等常见猪病毒病病原的鉴别诊断均为阴性;对分离的8株PRRSV进行检测,3株为经典毒株,5株为高致病毒株;对采集的59份确诊病料进行了检测,21份为经典毒株感染,38份为高致病毒株感染。本研究建立的RT-PCR诊断方法,具有特异、灵敏、快速等特点,可用于区分PRRSV经典与高致病毒株。; 肖跃强管宇唐娜魏凤杨慧曲光刚沈志强; 关键词：PRRSV NSP2基因 RT-PCR

PRRSV HN25株ORF5基因的克隆和重组腺病毒的构建: 2010年; 克隆PRRSV HN25株ORF5基因,测序并进行序列分析。结果显示ORF5基因编码区长603bp,编码200个氨基酸,与国内外VR-2332株、LV株和CH-1a株ORF5基因的核酸序列同源性分别为99.0%,63.8%和91.4%,而推导的氨基酸序列同源性分别为98.0%,58.8%和90.5%。构建含ORF5基因的重组腺病毒穿梭质粒,PmeI酶切线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,同源重组后筛选重组腺病毒质粒,经PacI酶切后转染293A细胞进行包装,获得重组腺病毒。通过PCR鉴定重组腺病毒含有ORF5基因,Western blot检测的结果表明PRRSV ORF5基因在293A细胞内获得表达。; 于新友沈志强管宇南松剑王金良肖跃强唐娜; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5基因重组腺病毒

PRRSV GP5和PCV2 ORF2双基因共表达重组腺病毒的构建及鉴定被引量：1: 2009年; 为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因和猪圆环病毒2(PCV2)ORF2双基因共表达重组腺病毒。将扩增的PRRSV GP5基因和PCV2 ORF2基因通过IRES元件串联,构建重组腺病毒穿梭质粒。PmeⅠ酶切线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,同源重组后筛选重组腺病毒质粒,经PacⅠ酶切后转染293A细胞进行包装,获得重组腺病毒。PCR鉴定表明重组腺病毒含有GP5和ORF2基因,western blot检测结果表明GP5基因和ORF2基因在293A细胞内获得表达。; 于新友沈志强管宇南松剑王金良肖跃强唐娜; 关键词：GP5基因重组腺病毒

细胞永生化技术及其应用研究进展: 细胞永生化是目前细胞生物学研究的热点之一。引起细胞永生化的因素很多,其中端粒酶在这一过程中发挥重要作用。细胞永生化技术在未来的成功应用,不仅为生物制品的研究与开发提供了有力工具,而且也为疾病的诊断与治疗提出了新的思路。该...; 庄金秋梅建国王文秀沈志强; 关键词：细胞永生化端粒酶; 文献传递

猪圆环病毒2型Cap蛋白表达及其间接ELISA诊断试剂盒研制被引量：5: 2010年; 根据已知猪圆环病毒2型(PCV2)序列设计引物,PCR扩增出579 bp去除信号肽的ORF2基因片段,将其克隆入表达载体pGEX-4T-1的BamHI和XhoI位点构建重组质粒,转化Rossetta(DM3)进行诱导表达,经检测表达蛋白以包涵体形式存在。用GST蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白,SDS-PAGE检测只存在一条约45.3 ku的目的条带,纯度达到90%以上。Western blot分析表明纯化的目的蛋白具有良好的免疫反应性。以纯化的蛋白为抗原,建立了间接ELISA诊断方法及组装了试剂盒,确定了最适的抗原包被浓度为0.625μg/mL,抗体稀释浓度为1∶100,确定临界值为0.371。该试剂盒与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)血清无交叉反应性;与北京世纪元亨公司ELISA试剂盒相比其特异性、敏感性、符合率分别为90%、93.3%、91%;对同份血清样品批内、批间重复性试验变异系数均小于10%;稳定性试验变异系数小于5%,在4℃条件下保存期可达12个月;对240份临床血清检出率为80%。结果表明,研制的ELISA诊断试剂盒具有良好的特异性、敏感性,重复性、稳定性,完全达到国内外同类产品质量要求,可大规模应用于临床检测。; 董林王艳萍沈志强王金良; 关键词：PCV2 间接ELISA 重组CAP蛋白

杂交猪IL-2和IL-6全基因克隆及序列分析被引量：2: 2009年; 为研究杂交猪白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素6(IL-6)在机体免疫应答中的作用,将杂交猪外周血淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下进行体外培养后,提取淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR技术扩增出杂交猪淋巴细胞IL-2和IL-6的cDNA,克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明:杂交猪IL-2基因核苷酸序列与参考序列的同源性为100%;IL-6基因核苷酸序列与GenBank登录的参考序列的核苷酸同源性在99.8%～100%之间,推导氨基酸同源性在99.1%～100%之间。; 沈志强汪明赵德明王金良唐娜曲光刚; 关键词：白细胞介素2 白细胞介素6 杂交猪

应用PCR法检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒被引量：6: 2012年; 为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒,根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计合成了1对特异性引物,其扩增产物长度为314bp,建立了PCR法,其特异性和敏感性较好。经与间接免疫荧光法进行同步比较试验,发现结果吻合性较高,且PCR法的结果更为直观,易于判断,样品保存方便,重检也方便,当日即可完成,显示出了较好的可行性。; 庄金秋毕研丽梅建国王金良苗立中沈志强; 关键词：禽网状内皮组织增生症病毒 PCR

应用PCR法检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒被引量：2: 2012年; 为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒,根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计合成了1对特异性引物,其扩增产物长度为314bp,建立了PCR法。经与间接免疫荧光法进行同步比较试验,发现结果吻合性较高,而且PCR法的结果更为直观,易于判断,样品保存方便,重检也方便,当日即可完成,显示出了较好的可行性。; 庄金秋梅建国毕研丽王金良苗立中沈志强; 关键词：禽网状内皮组织增生症病毒 PCR

仔猪圆环病毒2型与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断与病毒变异分析被引量：4: 2012年; 2010年,山东某规模化猪场2月龄仔猪群暴发未知疫病,发病率在80%以上、死亡率在50%以上。结合临床症状、剖检病变,以及PCR或RT-PCR检测,证实该猪场发生PCV-2与高致病性PRRSV混合感染。并且细菌病排查证实还混合感染了猪肺疫。通过对感染的PCV-2ORF2基因、PRRSV Nsp2基因部分序列进行分析显示,PCV-2毒株进化来源差异较大,毒株间核苷酸序列同源性仅为94.2%,但均属于2b基因型,在我国均广泛流行;高致病性PRRSV毒株序列同源性在99.7%以上,说明毒株进化来源同一,并且与近期报道毒株序列的同源性在99%以上,而与2006年分离毒株的序列同源性在95.8%～97.2%之间。以上结果表明,该猪场感染了不同进化来源的PCV-2,所感染的高致病性PRRSV高度同源,但相比2006年报道毒株已经发生一定程度的变异。; 肖跃强刘吉山吴忆春李峰吕素芳魏凤沈志强; 关键词：NSP2基因 PCV-2 ORF2

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