国家自然科学基金(30971249)
- 作品数：2 被引量：9H指数：2
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- 相关机构：复旦大学复旦大学上海医学院更多>>
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- U937单核细胞几种不同转染方法的比较被引量：7
- 2010年
- 目的采用不同质粒转染方法介导重组pIRES2-EGFP-TFPI-2质粒转染U937单核细胞,以获得较高转染效率的方法。方法分别采用电穿孔法、Effectene转染试剂、Lipofectamine 2000转染试剂、电穿孔+Effectene转染试剂、电穿孔+Lipofectamine 2000转染试剂及HilyMax转染试剂等不同方法介导质粒进行转染,测定不同方法的转染效率、目的基因mRNA表达水平及其对细胞活力的影响。结果电穿孔+Effectene转染试剂组、电穿孔+Lipofectamine 2000组及HilyMax组的转染效率和目的基因mRNA表达较高,且HilyMax组对细胞活力影响较小。结论将重组pIRES2-EGFP-TFPI-2质粒体外成功转染入U937单核细胞中,通过优化转染方法提高转染效率、降低对细胞活力的影响,为基因治疗提供了实验基础。
- 潘俊杰施海明罗心平李剑梁旺张进马端
- 关键词：转染效率电穿孔脂质体
- hTFPI-2基因重组腺病毒载体的构建和体外U937单核细胞的表达被引量：2
- 2011年
- 采用AdMax系统以复制缺陷型腺病毒为载体构建含有人组织因子途径抑制物-2(hTFPI-2)基因的腺病毒载体。用含EcoRI、SacI酶切位点的引物从pIRES2-EGFP-TFPI-2质粒中PCR扩增目的基因hTFPI-2,然后以限制性内切酶EcoRI和SacI消化hTFPI-2基因片段及腺病毒穿梭质粒PDC316-IRES-EGFP,用T4连接酶连接形成重组穿梭质粒PDC316-IRES-EGFP-hTFPI-2,与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre用脂质体Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒Ad-hTFPI-2。测序结果证明hTFPI-2序列正确,PCR、HindⅢ和Pac I酶切电泳证实腺病毒重组质粒Ad-hTFPI-2构建成功。经过扩增和CsCl结合法纯化后,利用穿梭质粒PDC316-IRES-EGFP中带有绿色荧光蛋白检测表达,测定病毒滴度为0.931×1012pfu/ml。重组病毒Ad-hTFPI-2对U937单核细胞感染率为89.33%。感染重组病毒较未感染时的上清TFPI-2浓度上升7倍左右,且对胰蛋白酶和纤溶酶具有抑制活性。成功地构建了能高效在U937单核细胞中表达hTFPI-2基因的重组腺病毒载体,为TFPI-2抗动脉粥样硬化作用的研究奠定基础。
- 潘俊杰施海明罗心平马端梁旺张进朱军李剑
- 关键词：腺病毒载体绿色荧光蛋白
