国家自然科学基金(81271362)
- 作品数：8 被引量：19H指数：3
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- Wnt7a基因对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及向神经元样细胞分化的影响被引量：3
- 2013年
- 目的研究Wnt7a基因过表达对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖和向神经元样细胞分化的影响。方法构建Wnt7a腺病毒,利用病毒感染MSCs,MTT法检测Wnt7a基因腺病毒感染前后MSCs增殖情况,Western blot检测细胞质和细胞核中β-catenin及CyclinD1表达的变化,比较诱导后向神经元样细胞的分化率。结果与对照组细胞相比,Wnt7a腺病毒感染组细胞增殖能力明显增强(P<0.05);细胞质和细胞核中β-catenin蛋白表达量均明显增加(P<0.05);CyclinD1的蛋白表达量也明显增加(P<0.05);诱导后向神经元样细胞分化率明显提高。结论 Wnt7a蛋白表达上调,可能通过提高β-catenin和CyclinD1表达来促进MSCs细胞增殖,Wnt7a蛋白同时促进MSCs向神经元样细胞的诱导分化。
- 周长立任先军蒋涛王开见阴洪
- 关键词：腺病毒载体骨髓间充质干细胞
- 京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架的制备及其生物力学特性研究被引量：2
- 2014年
- 目的 构建京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架,探讨京尼平交联改性对大鼠脱细胞脊髓支架抗酶解能力、生物力学性能及细胞毒性的影响. 方法 采用化学萃取法制备大鼠脱细胞脊髓支架,再用5 g/L京尼平溶液进行化学交联改性.采用HE染色及扫描电镜观察未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架的微观结构,测量基质孔径大小.分别检测交联前后大鼠脱细胞脊髓支架的孔隙率、含水率以及在2.5 g/L胰酶溶液中的失重率.在Instron生物力学测试仪上检测正常大鼠胸段脊髓、未交联及京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架的极限牵张应力和弹性模量.将大鼠骨髓间充质干细胞分别在未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架浸提液中培养,采用MTT法检测细胞相对生长率,评价支架的细胞毒性. 结果 未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架拥有相似的三维网状孔隙结构,孔径大小约30 μm,孔隙率超过80％,两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；京尼平交联支架的含水率为（229.7±12.5）％,显著低于未交联支架的（283.4±11.2）％（P＜0.05）；京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架在胰酶溶液中各时相点的失重率明显低于未交联支架（P＜0.05）,生物力学测试其极限牵张应力和弹性模量则显著增强（P＜0.05）；未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架均未观察到明显的细胞毒性. 结论 京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架拥有与未交联支架相似的结构,但生物力学性能和抗酶解能力明显增强,且无明显细胞毒性,在脊髓损伤修复的组织工程研究中具有良好的应用前景.
- 蒋涛任先军阴洪王开见周长立田永阳
- 关键词：生物力学
- 超声辅助脱细胞脊髓支架的生物学特性研究被引量：2
- 2013年
- 目的采用超声振荡结合化学萃取法制备大鼠脱细胞脊髓支架，观察其三维结构及生物学特性，为脊髓组织工程研究提供理想的支架材料。方法采用超声振荡结合化学萃取（体积分数2％TritonX-100＋体积分数2％脱氧胆酸钠）方法对大鼠脊髓进行脱细胞处理（脱细胞脊髓组），对照正常大鼠脊髓组织（对照组），观察该脱细胞脊髓支架的大体形态、组织学及超微三维结构特点，并检测该支架材料的孔径大小、孔隙率、含水率、酶解率、在水溶液中稳定性等。结果脱细胞脊髓组原有的细胞成分被有效去除，具有（94．57±3．45）％的孔隙率和（88．62±1．0）％的含水率以及良好的三维空间结构（平均孔径为46μm），该支架在胰酶溶液中逐步降解，在第20小时达到（69．03±2．19）％，在双蒸水中逐步崩解，在第8天可达（62．55±1．70）％。正常脊髓组织结构紧密，含大量神经细胞及髓鞘，孔隙率和含水量分别为（0．04±0．02）％、（62．4±1．5）％，扫描电镜下未见明显孔隙结构，该支架在胰酶溶液中逐步降解，在第20小时达到（37．62±0．99）％，在双蒸水中逐步崩解，在第8天可达（40．97±0．81）％。结论超声振荡＋化学萃取所制备的脱细胞脊髓支架细胞成分去除彻底，细胞外基质成分保存完整，具有良好三维空间网状结构、良好的孔隙率和含水量，符合组织工程脊髓支架的理论要求，为组织工程脊髓支架提供理想的选择。
- 阴洪任先军蒋涛周长立王开见
- 关键词：脊髓损伤超声处理
- 京尼平交联对大鼠脱细胞脊髓生物学特性的影响被引量：3
- 2013年
- 目的探讨新型生物交联剂京尼平对大鼠脱细胞脊髓生物学特性的影响。方法从成年SD大鼠(体质量200～250 g,雌雄不限)获取大鼠胸段脊髓,采用化学萃取法对大鼠脊髓组织进行脱细胞处理,再用生物交联剂京尼平(5 g/L)进行化学交联。分别采用HE染色和扫描电镜观察京尼平交联前后脱细胞脊髓的微观结构,并进行孔径大小、交联率、含水量、在PBS溶液及胰酶溶液中的稳定性能检测,再将大鼠骨髓间充质干细胞分别与京尼平交联前后的脱细胞脊髓浸提液共培养,采用MTT法在体外评估该支架材料交联前后的细胞毒性情况。结果京尼平交联前后的脱细胞脊髓拥有类似的多孔结构,孔径大小约30μm,最终交联率可达90%,交联后的脱细胞脊髓含水率从(283.4±11.2)%降至(229.7±12.5)%,但其在PBS及胰蛋白酶中的稳定性得到了明显的增强。交联前后的脱细胞脊髓都未观察到明显的细胞毒性。结论京尼平交联的脱细胞脊髓部分生物学特性得到改善,为应用于脊髓损伤修复的组织工程材料提供了一种新的选择。
- 蒋涛任先军阴洪田永阳唐北川王开见
- 关键词：京尼平化学交联细胞毒性
- 慢病毒转导增强型绿色荧光蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响被引量：5
- 2013年
- [目的]研究慢病毒载体(lentiviral vectors,LVs)介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)标记大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的可行性及对细胞生物学特性的影响。[方法]采用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,经Lenti-emGFP/hygro慢病毒载体转染和潮霉素药筛,镜下观察细胞形态和eGFP表达情况,MTT法检查转染前后细胞增殖活力,流式细胞仪检测细胞表面标记物(CD34、CD44、CD45、CD90)和eGFP,检测转染后细胞的成骨、成脂分化潜能并分别行茜素红染、油红O染色鉴定。[结果]大鼠BMSCs呈成纤维细胞样形态,漩涡样状排列,转染后细胞形态不变,并高效表达eGFP,两组细胞增殖活力一致,流式细胞仪检测显示,转染后的P3代大鼠BMSCs-eGFP的eGFP阳性率为99.97%,转染前后,两组细胞CD34和CD45阳性率低于2%,而CD44和CD90阳性率高于99%。转染后的P3代大鼠BMSCs-eGFP成骨诱导后,茜素红染色,可见呈桔红色的块状钙结节,成脂诱导后,油红O染色显示有大量红色脂质沉淀,成骨成脂诱导过程中,eGFP持续表达。[结论]Lenti-emGFP/hygro转染大鼠BMSCs并经潮霉素药筛后,eGFP可稳定高效表达,对细胞的生物学特性无明显影响,是一种较为理想的标记方法。
- 蒋涛任先军阴洪田永阳周长立王开见
- 关键词：骨髓间充质干细胞基因转染慢病毒载体增强型绿色荧光蛋白
- 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化研究的体外实验被引量：2
- 2013年
- 目的分离培养较高纯度大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),检测其多向分化潜能。方法采用密度梯度离心结合差速贴壁法分离培养大鼠BMSCs,观察细胞形态,检测表面标志物CD34、CD44、CD45、CD90表达情况,及其成骨、成脂、成神经诱导后茜素红染色、油红O染色和NSE、GFAP免疫荧光染色情况。结果细胞呈典型的成纤维细胞样形态,CD44和CD90呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达,细胞纯度>98%。成骨、成脂、成神经诱导后,茜素红染色、油红O染色、NSE和GFAP免疫荧光均为阳性。结论密度梯度离心结合差速贴壁法可分离、培养出高纯度的大鼠BMSCs,该细胞具有成脂、成骨、成神经多向分化潜能,是脊髓损伤修复的一种较理想的种子细胞。
- 蒋涛任先军阴洪周长立王开见
- 关键词：间质干细胞细胞培养技术细胞分化
- EDC交联结合化学萃取制备脱细胞脊髓支架及其生物学特性研究被引量：2
- 2016年
- [目的]采用EDC(碳化二亚胺)交联结合化学萃取法制备脱细胞脊髓支架,探讨脱细胞脊髓支架制备效率,分析支架的生物学特性,观察支架能否保留细胞外基质黏多糖成分。[方法]采用EDC交联结合化学萃取法(液氮结合42℃恒温水浴反复冻融6次+1%Triton X-100+1%脱氧胆酸钠+EDC交联+液氮结合42℃恒温水浴反复冻融6次+1%Triton X-100+1%脱氧胆酸钠)处理正常脊髓20根,得到脱细胞脊髓支架(支架组);对照于正常大鼠脊髓组织(对照组)。通过HE染色检验支架组脱细胞效果,统计脱细胞脊髓支架的等级评分"优"、"良"、"一般"、"差"的百分比;选取HE染色脱细胞彻底、评分为"优"的脊髓支架,DAPI染色验证其内部细胞残留情况的等级评分是否一致为"优";通过电镜扫描观察两组内部三维结构并分析其孔径;分析脊髓组织脱细胞处理前后的含水率、孔隙率、抗酶解性的变化;通过免疫组化的方法,观察两组材料细胞外基质中黏多糖分布情况。[结果]支架组通过HE染色观察到脱细胞彻底、评分为"优"的百分比为80%;HE染色观察评分为"优"支架经DAPI染色验证其内部细胞残留量评分也为"优";其三维结构完整,其孔径均值为9.07μm;含水率为(228.14±19.39)%;孔隙率为(71.82±2.10)%;在胰酶中,第20 h的酶解率平均为(35.904±1.911)%;免疫组化分析鉴定细胞外基质中包含一定的黏多糖。对照组中正常脊髓经HE染色和DAPI染色观察到大量细胞;三维网孔状结构,孔径均值为40.7μm;含水率和孔隙率分别为(109.32±12.44)%和(61.18±4.19)%;在胰酶中,第20 h的酶解率平均为(25.704±1.030)%;细胞外基质中包含大量的黏多糖成分。[结论]EDC交联结合化学萃取法制备的支架脱细胞彻底、制备效率高,具有三维网状结构、良好的含水率、空隙率、抗酶解性,一定程度上保留细胞外基质中黏多糖成分,符合组织工程学支架制备要求,为脊髓支架提供了一种�
- 邢辉任先军蒋涛阴洪孙超李邦银
- 关键词：脊髓损伤黏多糖
- 大鼠骨髓间充质干细胞与脱细胞脊髓支架体外共培养被引量：1
- 2013年
- 目的评价脱细胞脊髓支架在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养中的作用,探索最佳接种浓度。方法分离、培养及鉴定SD大鼠BMSCs,诱导BMSCs向神经元样细胞分化。制备脱细胞脊髓支架,将第3代BMSCs同脱细胞脊髓支架共培养,MTT法检测细胞增殖活性,比较与普通培养的差异;取第3代BMSCs以不同浓度[(0.5、1、2、3、4)×106/mL]接种于支架(脊髓支架修整0.5cm小段),检测细胞在支架上的粘附率及上架细胞数,建立接种浓度与细胞粘附率、上架细胞数的关系回归方程;扫描电镜观察脱细胞脊髓支架形态以及细胞与支架的粘附情况。结果成功实现BMSCs的分离及培养,BMSCs流式鉴定CD29、CD90阳性表达,向神经元诱导胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)呈阳性表达;与普通培养相比,BMSCs在支架上细胞增殖活力显著提高(P<0.05);细胞与支架的粘附率在接种浓度为2×106/mL最高,达到(79.6±2.7)%,单位体积上架细胞数达到(1.364±0.047)×106/cm3;扫描电镜观察支架空间结构良好,细胞与支架粘附良好,共培养第3天较第1天细胞数量明显增加。结论脱细胞脊髓支架具有多通道的空间结构,适合BMSCs粘附、存活、增殖,该支架是良好的天然脊髓组织工程材料。当粘附率及细胞上架数基本达到最大时的最佳接种浓度为2×106/mL。
- 王开见任先军蒋涛周长立阴洪
- 关键词：骨髓间充质干细胞细胞共培养
