河北省教育厅科学技术研究计划(2006308)
- 作品数：8 被引量：20H指数：3
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- 相关机构：河北大学北京师范大学北京首都机场物业管理有限公司更多>>
- 发文基金：河北省教育厅科学技术研究计划河北省科学技术研究与发展计划项目河北省生物工程重点学科资助更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程更多>>
- 化学渗透法破碎基因重组E.coli提取重组人SOD包含体和复性被引量：5
- 2011年
- 以化学渗透法破碎重组大肠杆菌细胞释放重组人超氧化物歧化酶(rhSOD)包含体并对其复性。选择四种化学试剂(Triton X-100、EDTA、NaOH和SDS)对rhSOD重组大肠杆菌细胞进行破碎实验,以SDS-PAGE检测破菌效果,结果0.5%Triton X-100和10 mmol·L-1 EDTA可以较好地破碎重组大肠杆菌细胞,所提取的包含体溶解液纯度与超声法相近,可达65%左右。采用透析法复性包含体,尿素终浓度0.1 mol·L-1时rhSOD包含体复性效果优于1.0 mol·L-1,比活分别为:Triton法2800 U·mg-1,EDTA法3200 U·mg-1,超声法2800 U·mg-1,复性rhSOD纯度达85%左右。本研究建立的用于破碎重组大肠杆菌释放rhSOD包含体的Triton法和EDTA法,包含体复性后比活等于或高于超声法,与机械破菌法相比,简便有效,成本低廉,无需特殊破菌设备,为放大规模破菌提取重组大肠杆菌包含体和复性奠定了实验基础。
- 刘建荣王慧赵晓瑜静天玉
- 关键词：细胞破碎包含体复性
- 以Triton X-100处理重组E.coli制备重组人SOD包涵体
- 2014年
- 为替代机械破菌法破碎重组E.coli释放重组人超氧化物歧化酶rhSOD(recombinant human SOD)包涵体蛋白,采用非离子表面活性剂Triton X-100处理重组E.coli释放并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体.以SDS-PAGE检测破菌效果,采用透析法体外复性包涵体.结果表明:经体积分数0.5%的Triton X-100处理重组E.coli制备的包涵体纯度可达65%,复性48h,目的蛋白比活达2 801U/mg,纯度达90%以上.与机械破菌法相比,简单实用,成本低廉,易于放大,无需特殊破菌设备,为规模化生产提供参考.
- 刘建荣顾雅君
- 关键词：包涵体TRITON复性
- 从EDTA处理的重组E.coli中分离纯化重组人SOD包涵体被引量：1
- 2009年
- 以金属离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放,并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体,纯度为65%。采用透析法复性包涵体,经凝胶色谱纯化后,目的蛋白纯度约为90%,酶比活力为5400u/(mg蛋白)。
- 刘建荣赵晓瑜王志远王慧静天玉
- 关键词：包涵体EDTA复性
- 重组人SOD工程菌发酵表达条件的优化
- 2011年
- 采用正交试验优化重组人超氧化物歧化酶工程菌的LB培养基,得到培养基最佳配比(g/L):蛋白胨12,酵母膏5,葡萄糖1和氯化钠10。以此为基础优化基因工程菌发酵条件,确定培养基初始pH 6.5～7.5,装液量20%,菌体密度(D_(600))0.55～1.4,42℃诱导表达2～3 h,目的蛋白相对表达量由优化前的25%提高至41%,绝对表达量是优化前的2.4倍。
- 刘建荣宋苍苍
- 关键词：基因工程菌发酵
- 重组人超氧化物歧化酶包涵体的复性和纯化被引量：5
- 2008年
- 当工程菌接种量为3%～5%,菌体密度(D600)达0.4～0.6,并于42℃诱导3～5h时,目的蛋白表达量约为总蛋白的30%。采用透析法使包涵体复性,经金属螯合亲和色谱和凝胶色谱两步纯化后,获得了纯度约为90%、比活力达7300u/(mg蛋白)的重组人超氧化物歧化酶。
- 刘建荣赵晓瑜步得志李宏博静天玉
- 关键词：发酵复性纯化
- 重组人Cu,Zn-SOD包含体的复性、纯化及复性蛋白稳定性研究被引量：9
- 2007年
- 目的通过体外复性和纯化技术获得具有高纯度、高生物活性的重组人铜锌超氧化物歧化酶（rhCu,Zn-SOD）,并研究复性蛋白的稳定性。方法以透析法对在大肠杆菌中以包含体形式表达的rhCu,Zn-SOD进行复性,采用金属螯合亲和层析对复性样品进行纯化,通过酶活性测定考查复性和纯化的rhCu,Zn-SOD的热稳定性、pH稳定性和对变性剂的稳定性。结果建立了体外透析复性的基本条件,其比活可达2 380 U·mg^-1。该复性样品经金属螯合亲和层析纯化后,结果得到纯度大于95%、比活5 000 U·mg^-1、活性回收率大于100%的目的蛋白。复性和纯化蛋白在温度25-70℃和pH 5.0-10.5内活性稳定,并可耐受2-10 mol·L^-1的尿素和2%-8%的十二烷基硫酸钠（SDS）,对更强烈的变性剂盐酸胍稳定性较弱。结论确定了重组人Cu,Zn-SOD包含体的体外复性条件和复性蛋白纯化方法,且复性蛋白表现出很好的稳定性,为重组人Cu,Zn-SOD的生产奠定了良好基础。
- 刘建荣赵晓瑜宋小青静天玉
- 关键词：包含体复性
- 自制纤维素金属螯合亲和膜的部分吸附性能及纯化牛血SOD被引量：2
- 2009年
- 自制纤维素金属螯合亲和膜,研究亲和膜对金属离子(Cu2+,Ni2+,Fe3+)和蛋白质的吸附性能,建立一种简便实用的纯化SOD的方法.以纤维素滤纸为原料,经交联制成可螯合金属离子的纤维素亲和膜,筛选确定与亲和膜吸附量最大的金属离子,并以卵清蛋白的吸附-解吸实验考查该膜对蛋白质的吸附性能.结果,在Cu2+,Ni2+和Fe3+中,亲和膜对Cu2+的吸附量最大,多次重复实验Cu2+吸附量稳定维持在4.60×10-6mol/cm2左右.Cu2+亲和膜对生理盐水溶卵清蛋白的吸附量高于无离子水溶卵清蛋白,可达113×10-6g/cm2,但蛋白解吸率前者低于后者,表明一定浓度的NaCl有助于亲和膜对蛋白质的吸附,同时也使被吸附的蛋白的解吸率有所降低.吸附-解吸方式(静态法)分离纯化SOD,解吸样品比活达8770 U/mg,纯度为81%;吸附-洗脱方式(动态法)分离纯化SOD,穿柱流出样品比活达12418 U/mg,纯度为85%.自制纤维素亲和膜有较好的吸附性能和纯化效果,重复使用性能良好,制备和纯化过程简便易行,具有广阔应用前景.
- 刘建荣张昊顾雅君赵晓瑜
- 关键词：纤维素超氧化物歧化酶(SOD)
- 国产和进口培养基发酵培养重组人SOD工程菌的比较研究被引量：2
- 2007年
- 目的以国产培养基替代昂贵进口培养基发酵培养重组人超氧化物歧化酶(rhSOD)工程菌。方法利用国产LB培养基对自行构建的含重组质粒pTK-rhSOD的基因工程菌E.coliDH5α通过摇瓶进行发酵培养,以SDS-PAGE分析方法考察不同菌体接种量(1%～5%)、菌体生长密度波长600nm处吸光度(A600)值、诱导时间(1～8h)、氨苄青霉素(Amp)浓度(终浓度150、200、250μg/ml)及加入时机(分别于接种前和诱导前加入)、摇瓶装液量(10%～40%)和诱导温度(42、43、44、45℃)对rhSOD表达的影响,优选最适培养条件,并与进口LB培养基进行比较。结果对于国产LB培养基,采用3%～5%接种量,菌体密度生长至A600达0.38～0.63,诱导前补加Amp由初始的100μg/ml至200μg/ml,于42～44℃诱导3～5h,rhSOD表达量可达30%;对于进口LB培养基,采用2%接种量,菌体密度生长至A600达0.55～0.93,诱导前补加Amp由初始的100μg/ml至150μg/ml,于42～43℃诱导2～4h,rhSOD表达量可达30%。两种培养基摇瓶装液量对rhSOD的表达均没有明显影响。结论国产LB培养基经条件优化后可获得与进口培养基相同的目的蛋白表达量,可以替代昂贵的进口产品,为rhSOD进一步规模化生产降低发酵成本提供了实验依据。
- 刘建荣赵晓瑜步得志顾雅君静天玉
- 关键词：超氧化物歧化酶重组蛋白质类培养基
