国家自然科学基金(31072120)
- 作品数：11 被引量：26H指数：3
- 相关作者：崔玉东朱战波宋佰芬马金柱于立权更多>>
- 相关机构：黑龙江八一农垦大学四川大学华西医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金黑龙江省研究生创新科研项目国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 一个金黄色葡萄球菌蛋白磷酸酯酶基因的克隆表达及酶活性测定被引量：1
- 2016年
- 金黄色葡萄球菌是一种引起人畜多种感染的主要病原菌,开发治疗金黄色葡萄球菌感染的新药途径之一是药物寻靶。研究克隆了一个金黄色葡萄球菌基因,并进行了蛋白诱导表达和酶活性测定。结果表明,该基因编码的蛋白具有丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶活性。实验结果为进一步挖掘该蛋白作为药物靶标的潜在功能奠定了基础。
- 吕茂利于立权秦学功崔玉东
- 关键词：金黄色葡萄球菌蛋白磷酸酯酶活性测定
- 金黄色葡萄球菌IsdD基因的克隆与表达被引量：1
- 2011年
- 金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜致病菌,IsdD属于金黄色葡萄球菌Isd系统中的重要成员。本研究根据Gen-Bank报道的金黄色葡萄球菌IsdD基因序列设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板扩增出目的片段Is-dD,将其用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到载体pET32a(+)上,构建重组质粒pET32a(+-)IsdD。序列分析结果显示,目的基因序列与网上的IsdD序列相比核苷酸序列和氨基酸序列同源性均在98%以上。将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中并成功诱导表达出大小为61.3ku的蛋白,这为下一步研究IsdD蛋白的结构和功能奠定了良好基础。
- 马金柱宋佰芬王北艳曹宁于立权崔玉东朱战波
- 关键词：金黄色葡萄球菌
- 树突状细胞免疫功能的研究进展被引量：2
- 2012年
- 树突状细胞（Dendritic cells，DCs）是因其成熟的细胞具有许多树突样或伪足样突起，被命名为树突状细胞^[1]。目前，DC是所知体内抗原提呈功能最强的专职抗原提呈细胞（Antigen-presenting cell，APC）^[2]。近些年，随着对DC分布、发育和功能等方面研究的不断深入，人们发现DCs在免疫系统中具有独特的地位，与其他APC相比，
- 马金柱宋佰芬崔玉东
- 关键词：细胞免疫功能树突状细胞抗原提呈细胞DCSCELL免疫系统
- 金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A r10-11截短体蛋白基因片段的原核表达与免疫原性被引量：2
- 2018年
- 目的构建金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(fibronectin binding protein A,FnBPA)r10-11截短体融合蛋白的原核表达菌株并研究其免疫原性。方法采用重组聚合酶链反应(ploymerase chain reaction,PCR)技术从金黄色葡萄球菌Newman株全基因组序列中进行PCR扩增,对扩增产物进行纯化,连接T载体后转入大肠杆菌DH5α中进行克隆,提取重组后的质粒进行双酶切鉴定,并回收目的片段连接到pET-32a质粒中,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,采用HIS蛋白纯化柱纯化截短蛋白FnBPAr10-11,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴定,纯化后的FnBPAr10-11用于免疫小鼠[分为无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)组、FnBPA组、FnBPAr10-11组],检测小鼠血清免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)水平、细胞因子水平、免疫保护率。结果 SDS-PAGE分析显示,表达后的蛋白相对分子质量约为33.1×103。FnBPAr10-11组与FnBPA组IgG抗体效价达1∶128 000,与PBS组比较差异有统计学意义(P<0.05)。FnBPAr10-11组的细胞因子水平与FnBPA组比较差异无统计学意义(P>0.05),与PBS组比较差异有统计学意义(P<0.01)。攻毒试验中FnBPAr10-11组的免疫保护作用在50%以上。结论成功构建了金黄色葡萄球菌Fn BPAr10-11截短体融合蛋白的原核表达菌株,该截短蛋白免疫原性良好。
- 杨汐静陈晓婷刘道龙杨阳杨光
- 关键词：金黄色葡萄球菌免疫原性
- 停乳链球菌GapC_(1-150aa)蛋白单克隆抗体的制备及其线性表位鉴定被引量：3
- 2015年
- 链球菌GapC蛋白是表达于各种链球菌的膜蛋白，具有良好的免疫原性。为研制预防链球菌感染的表位疫苗和研发以单克隆抗体（MAb）为基础的检测试剂盒，本研究利用表达的停乳链球菌GapC蛋白aa1～aa150片段制备了3株MAbs，并利用噬菌体展示技术对这3株MAbs的抗原表位进行分析，获得一个线性表位1377HDILDG142。该研究不仅有助于了解链球菌GapC的免疫保护作用机制，也有助于进一步研究表位疫苗和建立检测方法。
- 张丽萌周雪魏玉华樊自尧汤炜代建杨轩张建新杨汐静刘道龙王成王健南于永忠吴志军于立权孙虎男马金柱宋佰芬朱战波崔玉东
- 关键词：停乳链球菌GAPC单克隆抗体B细胞抗原表位
- 定点突变阻止金黄色葡萄球菌α-溶血素溶血活性被引量：3
- 2014年
- 金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素是导致肺炎的重要致病因子。为进一步研究金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-hla)的分子致病机理以及对其进行免疫预防,对α-hla第35位氨基酸进行了定点突变。用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureus wood46株基因组中扩增出α-hla基因,再利用重叠延伸PCR技术,将第35位带正电荷的组氨酸(密码子为CAC)突变为非极性的亮氨酸(密码子为CTC)。hlaH35L基因测序结果显示第35位的组氨酸突变为亮氨酸,构建的重组表达质粒pET-28a-c(+)/hla和pET-28a-c(+)/hlaH35L在E.coli BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白α-Hla及hlaH35L大小均为33.4 kDa,α-Hla引起兔红细胞溶血,hlaH35L未引起兔红细胞溶血。成功表达并获得了失去溶血毒性的重组蛋白hlaH35L。
- 代健樊自尧杨轩张丽萌陈战球崔玉东
- 关键词：金黄色葡萄球菌定点诱变原核表达溶血活性
- 盐酸小檗碱对小鼠脾细胞增殖和凋亡及分泌细胞因子的影响被引量：8
- 2013年
- 目的研究盐酸小檗碱(BBR)对小鼠脾细胞增殖与凋亡及细胞因子产生的影响。方法采用无菌取BALB/c小鼠脾脏,制成脾细胞悬液,脾细胞预先用(1、2、4)μg/mL BBR处理60 min,加入刀豆蛋白(ConA)刺激脾细胞增殖,细胞培养至24、48、72 h时,用MTT方法检测脾细胞增殖情况;流式细胞术检测脾细胞培养不同时间的凋亡情况,用细胞因子ELISA检测试剂盒定量分析细胞上清液中TNF-α,IL-2和IFN-γ的浓度。结果与对照组相比,在以上浓度范围内,BBR对ConA刺激下实验组小鼠脾细胞的增殖和TNF-α,IL-2,IFN-γ产生有明显的抑制作用(P<0.05),且呈浓度及时间依赖性,但对小鼠脾细胞凋亡无明显影响(P>0.05)。结论 BBR对小鼠脾细胞具有明显的免疫抑制作用,可作为潜在的免疫抑制药物。
- 马金柱宋佰芬阮宏生周鹏双崔玉东
- 关键词：盐酸小檗碱细胞增殖细胞凋亡细胞因子
- 鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表达及纯化被引量：1
- 2012年
- 对鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白FliC的基因进行克隆、鉴定和原核表达,为鞭毛蛋白佐剂作用的研究奠定基础。以鼠伤寒沙门氏菌8014菌株基因组DNA为模板,PCR扩增Flic基因,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pQE30(+)连接构建重组表达质粒Flic-pQE30,将此重组质粒转化入表达宿主E.coli XL1-Blue菌株内抽提质粒,酶切鉴定正确后对转化菌株以IPTG进行诱导后,表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。测序结果显示,FliC为完整的编码区基因1 485 bp,编码495个氨基酸残基,蛋白相对分子质量约为56 kDa。经SDS-PAGE分析表明,以37℃、1 mM的IPTG诱导5 h,表达效果最好,诱导产物是与理论值相符的56 kDa的融合蛋白。经western-blotting检测,表达的重组蛋白FliC可与小鼠抗鼠伤寒沙门氏菌全菌体多抗血清反应得到清晰的目的条带,表明表达的重组蛋白具有良好的反应原性。成功进行了鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白Flic基因的克隆表达,为进一步研究其免疫佐剂作用奠定了基础。
- 王鹤梁宏儒胡旭赵达姜东君尹辉高佳滨陈为宏崔玉东朱战波
- 关键词：鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白克隆
- 无乳链球菌GapC蛋白和鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合表达及纯化被引量：4
- 2013年
- 目的构建无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)gapC基因和鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimu-rium,S.typhimurium)fliC基因的融合基因gapC-fliC,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法应用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC基因和无乳链球菌gapC基因片段,通过柔性肽(Gly4Ser)2编码序列将二者串联并克隆至质粒pQE-30上,构建重组原核表达质粒fliC-gapC-pQE30,转化E.coli XL1-Blue,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行Western blot分析及融合蛋白活性检测。结果重组表达质粒fliC-gapC-pQE-30经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白FliC-GapC相对分子质量约95 000,表达量占菌体总蛋白的58%,主要以包涵体形式存在,且可与小鼠抗鼠伤寒沙门菌和抗无乳链球菌多抗血清发生特异性反应,具有较好的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性。结论成功构建了重组表达质粒fliC-gapC-pQE-30,并在E.coli XL1-Blue中表达了融合蛋白,为下一步动物免疫保护性试验的研究奠定了基础。
- 王鹤梁宏儒胡旭赵达姜东君尹辉高佳滨陈为宏崔玉东朱战波
- 关键词：鞭毛蛋白重组融合蛋白质类
- 应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌GapC1的大肠埃希菌被引量：1
- 2015年
- 目的应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌Gap C1-150 aa(Gap C1)的大肠埃希菌,为进一步构建大肠埃希菌表面展示重组菌株奠定基础。方法根据Gen Bank中登录的gap C基因序列(GI:30348860)设计引物,以质粒p KD3、p QE30/lpp-omp A-gap C为模板进行PCR扩增、融合,获得融合片段,转化入含p KD46质粒的大肠埃希菌HB101中,利用p KD46编码的RED系统将融合片段重组入基因组中,经氨苄西林(Amp)和氯霉素(Cm)抗性筛选,获得去除p KD46质粒的重组菌(HB101LOG)。对重组菌株进行PCR、Western blot、流式细胞术、荧光显微镜及生物学特性检测。结果 PCR结果显示,重组菌株构建正确;重组大肠埃希菌HB101LOG在菌体表面表达了外源蛋白Gap C1-150 aa;激光共聚焦显微镜观察到HB101LOG可见明显的绿色荧光,HB101未见绿色荧光;重组菌株HB101LOG和HB101的生长曲线符合大肠埃希菌的生长规律。结论应用RED系统成功构建了能展示链球菌Gap C1-150 aa的大肠埃希菌重组菌株。
- 杨汐静张建新陈晓亭汤炜于思淼刘伟姚笛吴志军于立权朱战波崔玉东
- 关键词：链球菌大肠埃希菌RED同源重组
