上海市青年科技启明星计划(12QA1405000)
- 作品数：5 被引量：19H指数：3
- 相关作者：田军刘楠梅张金元程劲梅长林更多>>
- 相关机构：中国人民解放军第二军医大学解放军第四五五医院更多>>
- 发文基金：上海市青年科技启明星计划上海市科学技术委员会基础研究重点项目上海市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- CXCR4基因修饰对骨髓间充质干细胞向急性肾损伤微环境定向迁移的放大效应及机制被引量：4
- 2013年
- 目的:低氧/复氧预处理肾小管上皮细胞(HR-RTECs)体外模拟急性肾损伤(AKI),与CXCR4基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养,观察该共培养环境下CXCR4基因修饰对BMSCs定向迁移力的影响,探讨其可能机制,并以动物模型进一步验证。方法:Gateway技术构建含CXCR4目的基因的质粒[绿色荧光蛋白(eGFP)为示踪基因)],同时构建仅含eGFP的对照载体,以携带上述质粒的慢病毒为载体转染BMSCs合成CXCR4-BMSCs和null-BMSCs,检测转染细胞活力、分化潜能及CXCR4在转染细胞中的表达。RTECs于HR环境中各培养12h获得HR-RETCs。实验共分四组,将BMSCs、CXCR4-BMSCs、null-BMSCs分别与HR-RTECs共培养,BMSCs与RTECs共培养作为对照。培养48h后检测各组BMSCs的定向迁移能力,ELISA检测RTECs培养上清中基质细胞衍生因子1(SDF-1)浓度,Western印迹检测BMSCs内pAKT、pMAPK水平。构建AKI小鼠模型,随机分为BMSCs移植组、CXCR4-BMSCs移植组和null-BMSCs移植组,移植细胞均采用5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记,移植7d后处死,免疫组化法检测移植细胞在肾组织的分布。结果:成功转染的BMSCs活力及分化潜能均无变化,CXCR4表达在CXCR4-BMSCs中明显增加。HR-RTECs模拟的AKI共培养环境可增强BMSCs的迁移能力,空载体转染对BMSCs的迁移能力并无额外影响,但CXCR4修饰的BMSCs向AKI微环境的迁移细胞数进一步显著增加。HR-RTECs培养上清中的SDF-1浓度增加,与其共培养的三种BMSCs内的pAKT、pMAPK水平也均增加,且以CXCR4-BMSCs的pAKT、pMAPK水平最强。CXCR4基因修饰可显著增加AKI肾组织中BrdU+细胞(BMSCs)的比例。结论:AKI微环境对BMSCs有明显趋化作用,CXCR4基因修饰可进一步增强BMSCs的定向迁移能力,SDF-1/CXCR4轴为发挥作用的主要趋化因子/受体,其下游的AKT和MAPK通路为发挥作用的可能信号机制。CXCR4-BMSCs移植有望成为修复AKI的一种新的有效方法。
- 刘楠梅程劲黄健田军
- 关键词：复氧肾小管上皮细胞
- HO-1基因修饰对急性肾损伤微环境下骨髓间充质干细胞增生分化的影响被引量：3
- 2015年
- 目的观察经血红素加氧酶-1(HO-1)基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在急性肾损伤(AKI)微环境下的增生分化,并探讨其机制。方法 Gateway技术构建含HO-1目的基因的质粒,同时构建仅含示踪基因e GFP的对照载体;脂质体法转染293FT细胞获得慢病毒原液lenti-HO-1-e GFP和lenti-e GFP;稀释后分别感染BMSCs获得HO-1-BMSCs和e GFP-BMSCs(空载体对照),检测转染细胞的活力、分化潜能。制作缺血再灌注诱导AKI大鼠的肾脏匀浆上清(AKI-KHS),以正常大鼠肾脏匀浆上清(N-KHS)作为对照,分别干预BMSCs、e GFP-BMSCs和HO-1-BMSCs,构成空白组(BMSCs组)、对照组(BMSCs/N-KHS组)、BMSCs/AKI-KHS组、e GFP-BMSCs/AKI-KHS组和HO-1-BMSCs/AKI-KHS组,于37℃、5%CO2培养箱中培养3 d。MTT法检测培养BMSCs的生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡,透射电镜观察细胞超微结构变化,免疫组化法检测细胞内角蛋白18(CK18)表达,Western印迹对各组细胞内HO-1、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(p AKT)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p ERK)水平进行检测。用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。结果基因修饰并未改变BMSCs活力及多向分化潜能。与对照组比,BMSCs/AKI-KHS组的细胞生长抑制率和凋亡阳性细胞比例显著增加(t=12.581,t=16.283;P<0.05);经HO-1基因修饰后,HO-1-BMSCs/AKI-KHS组的细胞生长抑制率和凋亡阳性细胞比例均有显著下降(t=5.958,t=7.957;P<0.05)。AKI-KHS可诱导BMSCs出现肾小管上皮细胞样分化的超微结构改变,胞浆中可观察到CK18表达,以HO-1-BMSCs/AKI-KHS组的CK18+细胞比例最高(t=4.057,P<0.05)。与BMSCs/AKI-KHS组相比,HO-1-BMSCs/AKI-KHS组的细胞内HO-1蛋白水平显著增高(t=4.163,P<0.05),并伴随着细胞内p AKT、p ERK蛋白水平显著增高(tp AKT=14.305,tp ERK=7.148;P<0.05)。结论 HO-1基因修饰可改善AKI微环境下培养BMSCs的增殖,细胞凋亡减轻,向肾小管上皮样细胞转分化能力增加,HO-1的过表达及其下游的AKT、ERK�
- 刘楠梅王会玲韩国锋于秀峙田军胡伟锋张金元
- 关键词：血红素加氧酶-1急性肾损伤
- 过表达CXCR4的骨髓间充质干细胞对共培养低氧／复氧肾小管上皮细胞的修复作用被引量：3
- 2013年
- 目的构建CXCR4质粒并转染小鼠骨髓间充质干细胞（BMSC），与低氧／复氧（hypoxia／re—oxygenation，HR）预处理的肾小管上皮细胞（RTEC）共培养，观察CXCR4-BMSC对HR—RTEC的修复效应并探讨其机制。方法采用基因转染技术获得CXCR4-BMSC（CXCR4-BMSC／eGFP，eGFP为示踪基因）和null—BMSC（BMSC／eGFP），检测转染细胞的CXCR4表达。RTEC于低氧／复氧环境中各培养12h获得HR．RETC，体外模拟急性肾损伤（AKI）细胞模型。BMSC与HR—RTEC共培养12h，免疫荧光法检测HR—RTEC的凋亡细胞比例，Western印迹法检测HR—RTEC内的凋亡相关蛋白cleavedCaspase-3和Bcl．2水平，结晶紫法计数迁移BMSC数量。以HR-RTEC上清液分别干预BMSC、CXCR4-BMSC和null—BMSC，免疫荧光法检测各组BMSC角蛋白18（CKl8）的表达，ELISA法检测BMSC上清中骨形态发生蛋白7（BMP-7）、肝细胞生长因子（HGF）和白细胞介素10（IL—lo）的浓度。结果成功转染的CXCR4．BMSC可高效表达CXCR4。HR—RTEC分别与BMSC、CXCR4-BMSC、null—BMSC共培养后，凋亡细胞比例均有下降，尤以与CXCR4．BMSC共培养组降低最为明显，并伴随着细胞内cleavedCaspase．3水平显著降低、Bcl-2表达升高（均P〈0．05）。结晶紫计数显示CXCR4-BMSC向HR—RTEC培养室的迁移数量最多。经HR—RTEC上清液干预后，BMSC、CXCR4-BMSC和null．BMSC均仅能微量表达CKl8，各组间差异无统计学意义。CXCR4过表达可显著增加BMSC的BMP-7、HGF和IL—10分泌。结论过表达CXCR4的BMSC对共培养HR—RTEC的修复效应增强，BMSC的定向迁移能力增加和迁移BMSC的分泌能力增强可能是CXCR4-BMSC的作用机制。
- 刘楠梅梅长林张金元田军程劲
- 关键词：骨髓间充质干细胞肾小管上皮细胞低氧复氧CXCR4
- 红细胞生成素对急性肾损伤微环境下骨髓间充质干细胞定向趋化的影响被引量：7
- 2013年
- 目的观察骨髓间充质干细胞（BMSC）在体外模拟的急性肾损伤（AKI）微环境中的迁移特点，明确红细胞生成素（EPO）干预对BMSC迁移的影响，并探讨其可能机制。方法肾小管上皮细胞（RTEC）于低氧一复氧（HR）环境中各培养12h获得HR—RETC，体外模拟AKI。采用Transwell体系将BMSC与RTEC共培养。实验分7组：对照组（①组单纯BMSC培养）、BMSC．RTEC共培养组（②组）、BMSC-HR-RTEC共培养＋不同浓度EPO干预组（③组-⑦组，EPO浓度：0、1、5、10、50IU／ml）。共培养48h后检测各组BMSC迁移数量，Western印迹法分别检测下室RTEC内的基质细胞衍生因子1（SDF-1）表达及上室BMSC的磷酸化（P）MAPK、MAPK水平，ELISA法检测RTEC培养上清中的SDF．1浓度。结果BMSC向HR—RTEC培养室的迁移数量增加，EPO干预可放大此效应，以10IU／ml时最强[与③组比较，（46．67±7．37）个，HP比（19．00±2．37）个／HP，P〈0．051。③组HR-RTEC的细胞内SDF-1表达水平（0．37±0．01比0．19±0．01，P〈0．05）及培养上清中SDF-1浓度[（61．64±4．88）μg/L比（35．26±8．78）μg，L，P〈0．05]均高于未处理RTEC（②组），EPO干预可进一步增加其水平，以10IU／ml时最强[（⑥组与③组比较：（173．53±14．66）上班比（61．64±4．88）μg／L，P〈0．05]，并伴有BMSC内MAPK磷酸化增强。结论体外模拟的AKI微环境对BMSC有定向趋化作用，EPO干预可增强其趋化效果，其机制可能与SDF-1水平增加及SDF-1-CXCR4轴下游的信号蛋白MAPK的磷酸化有关。
- 刘楠梅梅长林张金元田军程劲王巍巍
- 关键词：骨髓间充质干细胞红细胞生成素肾小管上皮细胞
- 血红素氧化酶1过表达对急性损伤肾脏中骨髓间充质干细胞的影响被引量：3
- 2015年
- 目的:构建可高效表达血红素氧化酶1(HO-1)的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察HO-1过表达对移植BMSCs在缺血再灌注(I/R)诱导的急性肾损伤(AKI)肾脏中存活的影响,并探讨其机制。方法:基因转染技术获得HO-1-BMSCs和e GFP-BMSCs(空载体对照)。构建I/R诱导的AKI大鼠模型(I/R-AKI)并分别行BMSCs、e GFP-BMSCs和HO-1-BMSCs移植,移植3d后处死,检测大鼠肾功能及移植细胞在肾组织的分布。制作AKI的肾脏匀浆上清(AKI-KHS),体外干预培养的BMSCs、e GFP-BMSCs和HO-1-BMSCs,检测培养BMSCs的细胞凋亡、HO-1蛋白水平、氧化应激相关酶的活力及核因子κB(NF-κB)p65水平。结果:HO-1-BMSCs移植后,AKI大鼠肾脏中DAPI+细胞(BMSCs)比例最高,肾功能改善显著。经AKI-KHS干预后,培养BMSCs的TUNEL+细胞比例增加,HO-1过表达可显著逆转这一现象。AKI-KHS可诱导BMSCs细胞的HO-1表达增加,以HO-1-BMSCs/AKIKHS组升高最为显著,伴随着该组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)水平显著升高,丙二醛(MDA)和黄嘌呤氧化酶(XOD)活力降低,细胞内NF-κB p65核移位细胞比例也显著降低。结论:HO-1过表达可增强BMSCs在AKI肾脏微环境中的存活,HO-1的抗氧化作用及其下游NF-κB活化抑制为其可能的机制,期待可以解决移植干细胞在损伤靶器官中存活率低下的问题。
- 刘楠梅王会玲韩国锋于秀峙田军胡伟锋张金元
- 关键词：血红素氧化酶1骨髓间充质干细胞急性肾损伤核因子ΚB
