国家自然科学基金(81072115)
- 作品数：9 被引量：22H指数：3
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- 6-磷酸果糖激酶-2／果糖双磷酸酶-2同工酶3基因敲除小鼠模型的构建被引量：3
- 2015年
- 目的建立6-磷酸果糖激酶-2／果糖双磷酸酶-2同工酶3（PFKFB3）基因敲除小鼠模型。方法利用类转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）技术，通过构建针对PFKFB3基因的TALEN质粒，并将构建好的TALEN质粒在体外反转录为mRNA。利用原核显微注射分别将0．1μl转录后的浓度为50ng／山的mRNA注射到C57BL／6品系小鼠受精卵中，将受精卵回送到ICR代孕母鼠输卵管中，得到F0代基因敲除杂合子小鼠。将FU代饲养至10周龄后合笼，从而构建基因敲除纯合子小鼠。所有子代鼠出生1周后剪尾，提取RNA后反转录，PCR产物作为模板进行基因测序鉴定基因型。结果通过TALEN技术成功构建了f1D代基因敲除杂合子小鼠3只，基因测序结果表明分别于靶基因位置缺失了10、4、1对碱基对；因PFKFB3基因敲除纯合子具有胚胎致死性，6只F1代基因敲除小鼠的基因测序结果显示，针对靶基因，编号4、5的小鼠缺失了1对碱基对，6号小鼠缺失4对碱基对，7、8、9号小鼠缺失10对碱基对。结论成功构建了PFKFB3基因敲除杂合子（＋／-）小鼠．。
- 王骏李师耿王喻彭叔彬陈延雄韩飞李骏温星桥
- 关键词：基因敲除
- 微小RNA-488靶向6-磷酸果糖激酶-2／果糖双磷酸酶-2同工酶3基因对前列腺癌细胞增殖与糖酵解的影响被引量：5
- 2017年
- 目的 探讨微小RNA（miRNA，miR）-488对前列腺癌细胞株增殖及糖酵解能力的影响及其机制。
方法 实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测miR-488在前列腺癌细胞株的表达。生物信息学、双荧光素酶实验验证miR-488的靶点，转染miR-488模拟物24 h后，以25 μg蛋白行Western blot、Real-time PCR检测6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3（PFKFB3）的表达。转染miR-488模拟物或同时转染过表达PFKFB3质粒24 h后，细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测PC-3、DU145细胞增殖，通过糖摄取及乳酸分泌实验检测糖酵解能力。结果 与正常前列腺上皮细胞RWPE-1比较，miR-488在PC-3、DU145细胞中的表达水平分别为0.26±0.03（P＝0.031）、0.19±0.04（P＝0.021），而在22RV1、LNCaP细胞中的表达差异无统计学意义。上调miR-488表达后，PC-3、DU145细胞的糖摄取率分别为对照组的0.54±0.03（P＝0.042）、0.52±0.01（P＝0.032），乳酸分泌率分别为对照组的0.55±0.02（P＝0.037）、0.61±0.17（P＝0.048），提示糖酵解能力明显下降，细胞增殖能力明显降低。生物信息学及双荧光素酶实验均表明PFKFB3是miR-488的靶点，上调miR-488表达后，PFKFB3 mRNA及蛋白表达均明显降低。同时上调miR-488与PFKFB3表达后，细胞的糖摄取分别为0.79±0.12、0.82±0.11，乳酸分泌分别为对照组的0.77±0.07（P＝0.015）、0.83±0.04（P＝0.026），提示糖酵解能力升高。此外，细胞增殖能力也明显升高。结论 miR-488可通过下调靶蛋白PFKFB3的表达，从而调控前列腺癌细胞的增殖与糖酵解。
- 李小娟王骏李军温志强孙东麟李志广韩跃辅纪梓良冷区曾春贤温星桥
- 关键词：前列腺癌增殖糖酵解
- 6-磷酸果糖激酶-2／果糖双磷酸酶-2同工酶3基因对前列腺癌细胞增殖的影响被引量：1
- 2017年
- 目的观察6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3（PFKFB3）在前列腺癌组织中的表达及其对PC3和DU145前列腺癌细胞增殖的影响。方法采用免疫组织化学染色（抗体浓度1∶50）方法，观察PFKFB3基因在前列腺癌组织及癌旁组织中的表达。实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR，40个循环，188 bp）、Western blot法[30 μl，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）]检测PFKFB3 mRNA和蛋白在前列腺癌细胞及前列腺上皮细胞中的表达。采用平板克隆形成实验（40 μmol/L H2O2）与细胞生长实验[20 μl噻唑蓝（MTT）]对比观察敲除PFKFB3基因前后前列腺癌细胞的生长。结果PFKFB3基因在前列腺癌组织中的表达（2.42±0.16）明显高于癌旁组织（1.38±0.10），差异有统计学意义（P＝0.031）；前列腺癌细胞中PFKFB3 mRNA和蛋白表达水平均高于前列腺上皮细胞，分别为2.0～2.6倍和2.5～4.5倍（P＝0.015）；敲除PFKFB3基因后，平板克隆形成实验结果显示细胞克隆形成率为敲除前的22%～35%（P＝0.018），细胞生长实验结果显示前列腺癌细胞的增殖在第4天受抑制，为对照组的28%～30%（P＝0.026）。结论PFKFB3基因在前列腺癌细胞和组织中高表达，PFKFB3基因对前列腺癌细胞的增殖有一定的促进作用。
- 严彬元王骏李小娟吴涛曾春贤陈忠温志强李志广孙东麟权伟合周青春唐金琦续奇志温星桥
- 关键词：前列腺癌增殖
- miR-96调控生育酚结合蛋白的表达及前列腺癌细胞生长被引量：1
- 2012年
- 目的筛选并鉴定调控生育酚结合蛋白（TAP）的miRNAs，并观察其对前列腺癌细胞增殖的影响。方法生物信息学分析和双荧光报告筛选调控TAP的miRNAs；以前列腺组织总RNA1ug反转录并扩增TAP基因（SEC14L2，GeneID：23541）及其3’端非翻译区（3’-UTR），克隆入p3×FLAG—CMV TM7．1载体；miR-96类似物与TAP表达载体pCMV7．1-TAP、pCMV7．1-TAP-3’-UTR转染前列腺癌细胞DU-145，Westernblot检测TAP的表达，噻唑蓝（MTT）法观察DU-145的增殖。结果miR-96可作用于TAP的3’UTR；pCMV7．1-TAP-3’-UTR分别经NotI／BglⅡ、Sal I／Xba酶切后电泳，在1200、1400bp附近有目的条带，测序结果与GeneBank报道一致。Westernblot检测结果表明miR-96可使TAP表达下降65．1％（P〈0．05）。MTT分析显示对照组以及空载体转染组的细胞吸光度（A）值分别为0．972±0．023、0．967±0．042；pCMV7．1-TAP转染组、pCMV7．1-TAP-3’-UTR转染组的A值分别为0．625±0．037、0．731±0．043，差异均有统计学意义（P〈0．05）；pCMV7．1-TAP-3’-UTR和miR-96共转染组的4值为0．914±0．034，与对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论miR-96可通过3’-UTR调节TAP的表达，并减弱TAP对前列腺癌细胞增殖的抑制作用。
- 朱宝益李小娟蔡松旺蔡燚叶春伟王喻陶奕然冯淑君温星桥
- 关键词：前列腺癌增殖
- 微小RNA-23a调节前列腺癌细胞骨架蛋白的分子机制被引量：3
- 2012年
- 目的探讨微小RNA-23a（miR-23a）影响前列腺癌细胞骨架迁移及侵袭行为的分子机制。方法PC-3前列腺癌细胞转染siPAK6、miR-23a模拟物，48h后以共聚焦显微镜观察细胞骨架的改变；Westernblot法检测LIMK1、磷酸化LIMK1（p-LIMKl）、丝切蛋白（cofilin）和磷酸化丝切蛋白（p-cofilin）蛋白的表达。结果转染siPAK6组及miRNA一23a组PC-3细胞骨架的应力纤维均明显减少，肌动蛋白形态皱缩。Westernblot检测显示转染siPAK6组的p-LIMKl、p-cofilin的表达分别下降75％、80％（P〈0．01），而LIMKl、cofilin表达量无明显变化（P〉0．05）；转染miRNA-23a组的p-LIMKl、p-cofilin的表达分别下降60％、70％（P〈0．01），LIMKl、cofilin的表达量无明显变化（P〉0．05）。结论miR-23a可通过p21活化激酶6（PAK6）-LIMK1-cofilin信号通路，影响前列腺癌细胞骨架的重构，抑制癌细胞迁移及侵袭能力。
- 蔡松旺黄怀球李小娟陈锐涵蔡燚朱宝益陶奕然叶春伟温星桥
- 关键词：前列腺癌COFILIN
- 微小RNA-301a介导高糖促进前列腺癌细胞周期G1/S时相转换被引量：2
- 2013年
- 目的 探讨微小RNA（miR）-301a介导高糖促进前列腺癌细胞生长的分子机制.方法 通过实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测miR-301a的表达.细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测转染miRNAs和/或高糖（4.5 g/L）培养的前列腺癌DU145细胞的增殖.应用微管聚合抑制剂诺考达唑（Nocodazole,40 μg/L）处理16h或者血清饥饿处理48 h使细胞周期同步化,流式细胞仪分析miR-301a对细胞周期时相转换的影响.CCK-8法测定细胞生长活性,检测高糖及miR-301a对前列腺癌细胞增殖的影响.结果 miR-301a在前列腺癌细胞PC3、DU145的表达分别为正常前列腺上皮细胞RWPE-1的（2.86±0.75）倍和（4.05±0.96）倍.高糖培养DU145细胞24、48 h后miR-301a的表达分别为对照组的（1.88±0.34）倍和（13.15 ±3.45）倍.抑制miR-301a可部分逆转高糖的促增殖作用.过表达miR-301a后经细胞周期同步化处理,与对照组比较miR-301a可促进前列腺癌DU145细胞G1/S时相转换.结论 miR-301a在前列腺癌细胞中表达上调,miR-301a介导高糖促进前列腺细胞周期G1/S时相转换,促进细胞增殖.
- 蔡燚李小娟朱宝益陶奕然李骏蔡松旺陈锐涵温星桥
- 关键词：高糖前列腺癌细胞周期
- 微小RNA-23a-p21活化激酶6通路对前列腺癌细胞迁移与侵袭能力的影响被引量：8
- 2012年
- 目的探讨调控p21活化激酶6（PAK6）的微小RNA（miRNA）与前列腺癌侵袭及迁移的关系。方法生物信息学预测靶向PAK6的miRNA，转染miRNA模拟物及抑制剂，Western blot法及实时定量逆转录-聚合酶链反应（Real—timePCR）检测PC-3细胞PAK6的表达，荧光素报告酶实验检测预测NmiRNA对PAK6的调控，并行体外迁移及侵袭实验，检测转染miRNA对PC-3细胞迁移及侵袭能力的影响。结果生物信息学预测miRNA-23a可能是调控PAK6的靶miRNA。Westernblot检测转染miRNA-23a组PAK6表达量下降79％，而转染miRNA-23a抑制剂组PAK6表达量上升40％，差异均有统计学意义（P〈0．05）。荧光素报告酶实验结果显示，转染miRNA-23a后野生型PAK6组荧光素酶活性下降32％，而突变组差异无统计学意义（P〉0．05）。Real-timePCR检测3组PAK6mRNA的表达，差异无统计学意义（P〉0．05）。体外迁移及侵袭实验示，转染miRNA-23a组迁移细胞数减少57％，侵袭的细胞数减少91％。结论微小RNA-23a通过下调靶蛋白PAK6的表达从而引起前列腺癌迁移及侵袭能力下降。
- 蔡松旺李小娟陈锐涵朱宝益蔡燚叶春伟陶奕然冯淑君温星桥
- 关键词：微小RNA前列腺癌
- 前列腺癌miRNA表达谱及miR-96在氧化应激信号通路中的作用被引量：1
- 2012年
- 【目的】检测miRNA在前列腺癌与正常前列腺组织的表达差异,并探讨表达异常的miRNA在前列腺癌发病中的作用。【方法】前列腺癌和正常前列腺组织样品(100 mg),Trizol法提取RNA,应用聚合酶链反应(PCR)芯片检测miRNA的表达;同时以250μmol/L的过氧化氢(H2O2)刺激前列腺癌PC-3细胞4 h,继续正常培养12 h。检测不同时间点细胞内活性氧(ROS)水平,以实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-96在各组细胞中的表达。【结果】与正常前列腺组织相比,前列腺癌组织中miR-144、miR-216a上调5.9倍,miR-96上调30.4倍,miR-488、miR-873下调到4.9%,差异有统计学意义(P<0.05)。PC-3细胞内ROS为RWPE-1细胞的5.2倍(P<0.05),miR-96在PC-3细胞中的表达为RWPE-1细胞的15.4倍(P<0.05)。H2O2刺激PC-3细胞1、4 h后,胞内ROS为对照组的4.3、6.4倍(P均<0.05),miR-96表达水平为对照组的10.2、18.9倍(P均<0.05);10、16 h组胞内ROS为对照组的2.5倍、1.2倍,miR-96表达水平为对照组的2.7、1.9倍(P均>0.05)。【结论】在前列腺癌组织中发现了若干有表达差异的miRNA;miR-96参与前列腺癌细胞的氧化应激信号途径,可能是防治前列腺癌的重要分子靶点。
- 朱宝益李小娟黄怀球蔡燚叶春伟陶奕然高新温星桥
- 关键词：前列腺癌MIRNA氧化应激
- 生育酚结合蛋白基因重组腺相关病毒的制备及抗癌作用
- 2011年
- 目的制备生育酚结合蛋白（TAP）重组腺相关病毒，并探讨其对前列腺癌生长的作用。方法构建重组腺相关病毒质粒pSNAV-TAP-EGFP，酶切、聚合酶链反应（PCR）、测序。225cm2细胞培养瓶中，接种293T细胞，以重组质粒转染。扩增、纯化病毒，并转染DU-145细胞，噻唑蓝（MTT）比色法观察第2、4、6天的细胞增殖。结果成功构建pSNAV—TAP—EGFP质粒，并制备滴度6．4×10^11vg／ml、纯度95％的rAAV2-TAP。该病毒转染DU-145细胞后TAP表达量明显上升。转染后第4天，TAP转染组的细胞吸光度（A值）0．546±0．072，对照组以及空载体转染组的A值分别为0．673±0．015、0．638±0．051，生长明显受到抑制（P〈0．05）。至第6天各组细胞生长差异更显著。结论成功制备高滴度的rAAV—TAP—EGFP病毒，并可抑制前列腺癌细胞的生长。
- 李小娟王喻朱宝益叶春伟杨钦泰黄振华洪莹芬文娅温星桥
- 关键词：重组腺相关病毒前列腺癌增殖
