国家自然科学基金(81072167)
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
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- 蛋白酪氨酸激酶NOK/STYK1胞内区的表达与纯化
- 2014年
- 目的:酪氨酸蛋白激酶NOK/STYK1具有很强的促肿瘤形成和转移能力,被认为是很有前途的肿瘤治疗靶点。由于NOK含有一个跨膜区,且富含疏水性氨基酸,其表达和纯化非常困难,直接影响了对其功能及相关分子机理的深入研究。本研究目的是获得可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白△NOK(AA:49-422),为后续抗体的制备和功能研究奠定重要基础。方法:含有△NOK基因的原核表达载体,转入E.coli BL21中,IPTG诱导蛋白表达,通过亲和层析获得可溶的△NOK融合蛋白。融合蛋白经凝血酶酶切后,凝胶过滤层析分离标签蛋白获得△NOK蛋白。同时,我们还通过Bac-to-Bac系统获得含有△NOK基因的杆状病毒,感染sf9细胞,尝试在真核细胞中表达目的蛋白。结果:通过在sf9昆虫细胞和大肠杆菌表达系统中盐浓度等各种条件的摸索,首次获得了可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白(△NOK-GST)和一定量去除标签的△NOK蛋白。本研究中与大肠杆菌相比,昆虫细胞并不适合△NOK的纯化。结论:我们建立了一套优化的NOK蛋白表达和纯化体系,从而为后续抗体制备和各种体内外生化实验等功能研究奠定基础,为研究NOK在肿瘤中的作用和药物筛选创造条件。同时丰富了整个RTKs家族作用机制的探索,进一步促进了以RTKs为靶点的治疗手段在临床上的应用。
- 李蕊王琛吴放姜清波丁雪张淑平
- 关键词：凝胶过滤层析
