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二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达被引量：2: 2008年; 目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。; 佟敬山李昌金宁一于源华刘玉生于芳胡宁宁李霄张钰; 关键词：人免疫缺陷病毒 GP41 单链抗体原核表达稳定性

DNA表达载体构建及HIV多表位核酸疫苗的设计与表达被引量：3: 2007年; 目的利用塞姆利基森林病毒(SFV)复制子构建新型真核表达载体,并对含HIV-1中国流行株B亚型核心蛋白p24及多表位MEG嵌合基因的核酸疫苗进行表达与鉴定。方法将含SFV复制子的元件从pSFV-MCS中切下,连入含CMV启动子及增强子的pIRESneo载体中,构建新型真核表达载体pCS,再将含HIV-1 MEGp24基因插入至pCS载体中,构建重组核酸疫苗pCS-MEGp24。用脂质体法将重组质粒转染入BHK-21细胞,进行表达产物的检测。结果间接免疫荧光检测显示,重组质粒转染的BHK-21细胞能有效表达HIV-1 MEGp24,并与HIV阳性血清反应。结论所构建的核酸疫苗可在BHK-21细胞系内进行表达,且MEGp24基因的表达蛋白具有特异性,为构建新型HIV-1中国流行株核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。; 付延军金宁一金洪涛李臻辛苏文李萍韩贞珍李太元; 关键词：人免疫缺陷病毒复制子核酸疫苗

反转录病毒载体介导的EGFP基因在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中的表达被引量：1: 2011年; 为了构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的反转录病毒载体,并观察EGFP基因在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中的表达情况。试验将增强型绿色免疫荧光基因片段定向插入反转录病毒载体pFB-neo,获得重组反转录病毒质粒pFB-NE,利用三质粒共转染系统,将含有目的基因的重组反转录病毒质粒pFB-NE以及含有辅助病毒gag-pol和env基因的质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK-293细胞,用产生的重组反转录病毒感染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,并在荧光显微镜下观察EGFP基因的表达。结果表明:重组反转录病毒载体pFB-NE构建正确,重组病毒包装成功,EGFP基因在细胞中能够稳定表达。; 王婧李昌李林溪胡博丛艳昭任大勇王卓越杜寿文金宁一; 关键词：反转录病毒载体

治疗用质粒DNA的纯化工艺被引量：6: 2008年; 目的探索适合大规模生产治疗用质粒DNA的纯化工艺。方法采用中空纤维柱收菌、碱裂解,再应用中空纤维柱浓缩质粒,经分子筛、亲和、离子交换等层析分离纯化质粒DNA,并应用凝胶电泳、PCR、核酸蛋白检测仪、BCA蛋白检测试剂盒和内毒素检测试剂盒对所纯化的质粒DNA进行全面检定。结果所获得的超螺旋质粒DNA达到样品总质粒的91.2%;质粒DNA总纯度为1.8;内毒素含量小于10EU/mg;几乎检测不到蛋白质残留,未检出基因组DNA残留。各项指标均符合有关质量标准。结论所采用的纯化工艺省时省力,制备的质粒DNA纯度高,适用于大规模生产治疗用质粒DNA。; 丛艳昭鲁承金宁一申镇维梁晓枫金洪涛白靓牟伟锋于长勇常巧呈齐楷金明杰; 关键词：质粒DNA 纯化层析

金黄色葡萄球菌肠毒素A在枯草芽孢杆菌中的表达及其活性分析: 2010年; 利用优化后的SEA基因片段与带有枯草芽孢杆菌启动子的表达载体pBC38c,成功构建了含有SEA基因的重组表达质粒pBC38c-SEA。通过电转化的方法,将重组质粒pBC38c-SEA转入枯草芽孢杆菌1A751中。对目的蛋白进行表达,采用硫酸铵沉淀法浓缩上清中的蛋白,超声波裂解法裂解菌体沉淀,SDS-PAGE凝胶电泳法检测蛋白表达情况,Western-blot对表达的目的蛋白进行活性分析,并对表达条件与硫酸铵浓度进行优化。结果表明,成功构建了枯草芽孢杆菌表达质粒pBC38c-SEA,并在枯草芽孢杆菌中获得了表达,目的蛋白存在于培养基上清中,且具有抗原性。随着培养时间的延长,目的蛋白表达产量增多,在35h时达到最多,同时硫酸铵终浓度为50%,目的蛋白得到最好沉淀。本试验结果表明,SEA基因得以分泌表达,为进一步研究其生物活性并作为佐剂在临床中应用奠定了基础。; 韩佳丽李昌沈国顺胡博李霄田明尧孙珊珊叶明金宁一; 关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素A 枯草芽孢杆菌分泌表达

表达中国流行株HIV-1 gp120外膜蛋白靶细胞模型的建立被引量：3: 2008年; 利用pDispaly真核表达载体构建了用于表达中国流行株HIV-1gp120的真核表达质粒pD-120,通过脂质体转染法将其导入人宫颈癌细胞(HeLa),经G418反复加压筛选,直到细胞不再死亡为止,8代后获得稳定表达中国流行株HIV-1gp120蛋白的靶细胞复制模型HeLa-gp,SDS-PAGE,蛋白印迹与间接免疫荧光分析表明,重组蛋白得到很好表达,并具有良好生物活性,为抗AIDS/HIV治疗用基因工程制剂或靶向药物的活性检测奠定了坚实基础。; 李昌金宁一胡宁宁刘玉生佟敬山李霄金洪涛于芳; 关键词：GP120

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国家高技术研究发展计划(2006AA02Z447)