国家自然科学基金(30700290)
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
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- 相关机构：中南大学长治医学院附属和平医院长治医学院更多>>
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- 外源性核仁素转基因小鼠的构建与鉴定
- 2010年
- 目的最近研究表明核仁素(nucleolin,Ncl)蛋白作为一种内源性保护蛋白,在心肌细胞受损过程中发挥了重要的内源性保护作用。以往对核仁素发挥心肌保护作用的机制研究常局限于细胞水平。本研究构建并鉴定了携带有外源核仁素基因的转基因小鼠,为从整体水平上研究核仁素对心肌功能的影响,发挥心肌保护作用的机制提供动物模型。方法采用基因重组法将小鼠核仁素(Ncl)基因的全长cDNA置于α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子下游构建成α-MHC-Ncl重组载体,通过双酶切及基因测序鉴定其正确性;通过原核显微注射将该载体导入小鼠受精卵原核中,经注射且状态良好的受精卵回输至假孕雌鼠输卵管中,剪取0.5 cm仔鼠的鼠尾,收集DNA,进行PCR鉴定。结果双酶切及基因测序显示成功构建了α-MHC-Ncl重组质粒,将其显微注射到小鼠受精卵中,得到G0代小鼠106只,PCR确定了5只整合有Ncl基因的首建鼠。结论核仁素基因可以整合到小鼠体内,得到的转基因小鼠可能成为有效的动物模型,用于研究核仁素在心肌保护方面发挥的生物学作用。
- 周斌蒋碧梅
- 关键词：核仁素转基因心肌细胞小鼠
- 靶向核仁素RNA干扰载体的构建与筛选
- 2009年
- 目的:设计靶向大鼠核仁素的RNAi序列,构建6个RNAi真核表达载体,采用转染工具细胞筛选有效靶点。方法:根据GenBank中的核仁素序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至pGCsi-lencerTMU6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,将重组质粒用脂质体转染技术导入H9C2细胞,荧光显微镜检测GFP表达以判断转染效率,Western-blot检测靶细胞中核仁素蛋白水平的表达,筛选有效干扰序列。结果:经测序鉴定,克隆的RNAi打靶序列完全正确,无碱基突变。转染H9C2细胞36 h后,荧光显微镜下可检测到GFP标记的核仁素蛋白的表达,转染效率达75%以上。Western-blot结果显示3号核仁素干扰质粒(Ncl-3)能明显下调H9C2细胞的核仁素表达。结论:成功构建靶向核仁素RNA干扰载体,并筛选出效能最优序列,为进一步相关研究奠定基础。
- 宋娟张任飞张彬邓红兵蒋碧梅
- 关键词：RNA干扰核仁素质粒构建基因转染
