国家自然科学基金(30370653)
- 作品数：9 被引量：38H指数：4
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- 骨形态蛋白2 siRNA靶向抑制对体外培养人脐动脉平滑肌细胞成骨样分化及钙化的影响被引量：1
- 2010年
- 目的研究骨形态蛋白2(BMP2)小分子干扰RNA(siRNA)靶向抑制对人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)由白介素6(IL-6)诱导刺激的成骨样分化和细胞层钙化的影响。方法以体外培养的原代HUASMC作为实验对象。建立RNA干扰(RNAi)实验平台,通过FAM标记阴性对照siRNA优化转染条件;将BMP2基因的4条候选siRNA分别转染原代HUASMC,Real-TimePCR检测BMP2mRNA表达,筛选有效抑制siRNA。将复苏的原代HUASMC分为siRNA转染组(转染有效抑制siRNA)和模拟转染组(对照组,不转染siRNA),两组均加入重组人IL-6(rhIL-6)(10ng/mL)刺激孵育,Real-TimePCR检测刺激孵育12、48h时点成骨样转化相关基因BMP2、骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、骨钙素(OC)和骨桥蛋白(OPN)mRNA表达。将复苏的原代HUASMC分为siRNA转染组、对照组和空白组(不予rhIL-6刺激孵育,其余处理与对照组相同),siRNA转染组和对照组均加入rhIL-6(50ng/mL)刺激孵育,甲氧-酚酞络合酮法检测rhIL-6刺激孵育前及孵育后2、4d时点各组HUASMC细胞层钙盐含量,以总蛋白含量校正。结果成功建立合适的RNAi实验平台。10ng/mLrhIL-6刺激孵育后12h时点,siRNA转染组HUASMC BMP2和BAPmRNA表达明显低于对照组(P<0.05);刺激孵育后48h时点,siRNA转染组OC和OPNmRNA表达显著低于对照组(P<0.05)。加入50ng/mLrhIL-6刺激孵育前,siRNA转染组、对照组和空白组HUASMC细胞层钙盐含量比较差异无统计学意义(P>0.05);在siRNA转染组,50ng/mLrhIL-6刺激孵育后2、4d时点的细胞层钙盐含量均明显低于对照组(P<0.05),刺激孵育后2d时点的细胞层钙盐含量明显高于空白组(P<0.05)。结论体外培养的原代HUASMC能够实现BMP2基因的siRNA靶向抑制,能显著抑制由IL-6诱导刺激的成骨样分化和钙化。
- 孙明姝郭永平顾乐怡严玉澄倪兆慧钱家麒
- 关键词：成骨细胞分化钙化人脐动脉平滑肌细胞
- 普伐他汀抑制肿瘤坏死因子α介导的人脐动脉血管平滑肌细胞成骨样钙化被引量：1
- 2008年
- 目的研究普伐他汀干预对肿瘤坏死因子α（TNF-α）介导的人脐动脉血管平滑肌细胞（hUASMC）成骨样分化标志蛋白骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、骨桥蛋白（OPN）和骨形成蛋白2（BMP-2）表达以及细胞外钙盐沉积的影响，并探讨普伐他汀在血管钙化防治中的潜在作用。方法植块贴壁法原代培养人hUASMC。予以TNF-α刺激和普伐他汀干预，甲O-酚酞络合酮方法测定细胞外基质钙盐沉积；实时定量PCR法观察血管平滑肌细胞BAP和OPNmRNA表达水平；免疫印迹法观察血管平滑肌细胞BAP、OPN和BMP-2蛋白表达水平。结果-定浓度范围的普伐他汀呈浓度依赖方式抑制TNF—α对hUASMC的促增殖作用（r=-0．946，P〈0．01）；一定浓度范围的普伐他汀呈浓度依赖方式下调TNF-仅介导上调的BAP、OPNmRNA表达（r=-0．972，P〈0．01）与蛋白的表达水平（BAP蛋白，r=-0．820，P〈0．01；OPN蛋白，r=-0．972，P〈0．01；BMP-2蛋白，r=-0．928，P〈0．01），抑制血管平滑肌细胞成骨样分化，减少细胞外基质钙盐的沉积（r=-0．973，P〈0．01）。结论普伐他汀可抑制TNF—α对hUASMC的促增殖作用，抑制细胞成骨样分化，减少细胞外基质钙盐的沉积。
- 李振勇倪兆慧钱家麒戴慧莉顾乐怡郭永平孙明姝
- 关键词：普伐他汀钙质沉着症人脐动脉血管平滑肌细胞
- 骨相关蛋白与CRF患者并发动脉粥样硬化和瓣膜钙化的相关性被引量：4
- 2007年
- 目的探讨骨相关蛋白与慢性肾衰竭(CRF)患者并发动脉粥样硬化和瓣膜钙化的相关性。方法以75例CRF患者(其中有27例存在颈动脉斑块,23例检测到瓣膜钙化)和10例正常对照作为研究对象。采用ELISA法测定各组血中骨桥蛋白(OPN)、胎球蛋白-A(fetuin-A)和基质Gla蛋白(MGP)水平。比较骨相关蛋白水平与各组临床特征之间的关系。结果与对照组比较,CRF患者血中OPN水平显著升高,fetuin-A水平显著降低。存在颈动脉斑块和心脏瓣膜钙化CRF患者的OPN和fetuin-A水平改变尤为明显。OPN水平与颈动脉内膜厚度呈正相关。结论CRF患者血中OPN和fetuin-A水平与其动脉粥样硬化和心脏瓣膜钙化可能有关。
- 张敏芳徐筱琪钱家麒戴慧莉吴青伟倪兆慧
- 关键词：骨桥蛋白基质GLA蛋白动脉粥样硬化瓣膜钙化
- 白细胞介素6对体外培养人脐动脉平滑肌细胞成骨样转化、钙化的影响被引量：8
- 2009年
- 目的研究白细胞介素6（IL-6）对体外培养人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）成骨样转化、钙化的作用及可能的信号通路。方法组织植块法原代培养HUASMC。培养基加入不同浓度重组人IL-6（rhIL-6）孵育细胞，设空白对照组。茜素红S钙沉积染色及甲氧-酚酞络合酮法检测细胞层钙盐含量。实时定量PCR、荧光定量法以及Western印迹法分别检测骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、骨桥蛋白（OPN）、骨形成蛋白2（BMP2）和骨保护素（OPG）基因以及蛋白表达。凝胶迁移滞后实验（EMSA）检测核心结合因子α1亚基（Cbfα1）的结合活力，以及分别应用p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）抑制剂SB203580和蛋白激酶C二氢神经鞘氨醇（DHC）后Cbfα1的结合活力。结果rhIL-6 50μg／L诱导12d，细胞基质层茜素红S染色阳性。与对照组相比，细胞层钙盐含量在rhIL-610μg／L组刺激9d[（0．76_＋0．02）mmol／g蛋白1和12d[（1．54±0．11）mmol／g蛋白]升高，50μg／L组刺激6d[（1．81±0．03）mmol／g蛋白]、9d[（2．08±0．10）mmol／g蛋白]和12d[（3．22±0．18）mmol／g蛋白]升高，并呈时间、剂量依赖地增加。rhIL-6 10μg／L刺激12h，BMP2mRNA（3．04±0．07）和蛋白（8．14±0．41）及BAPmRNA（2．51±0．11）和蛋白（3．96±0．54）表达上调；刺激72h，OPN mRNA（3．14±0．32）和蛋白（2．57±0．43）水平及OPGmRNA（4．06±0．24）和蛋白（3．46±0．34）水平上调。rhIL-6刺激6h，Cbfα1结合活力增加；DHC能够部分抑制rhIL-6诱导的Cbfctl结合活力增加，SB203580没有明显作用。结论IL-6体外能够诱导HUASMC发生钙化和成骨样转分化，这可能是临床观察到IL-6与血管钙化相关的机制之一。IL-6的这一作用可能与细胞内蛋白激酶C通路的活化有关。
- 孙明姝郭永平顾乐怡戴慧莉严玉澄倪兆慧钱家麒
- 关键词：白细胞介素6脐动脉肌细胞平滑肌血管钙化骨形态发生蛋白质类
- 尿毒症血清诱导人脐动脉平滑肌细胞成骨样转化和钙化的研究被引量：2
- 2008年
- 目的研究尿毒症血清对原代培养人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）成骨样转化和细胞外基质钙沉积的影响。方法收集40例健康人、40例非透析尿毒症患者和45例透析尿毒症患者血清，检测有关生化指标。组织植块法原代培养HUASMC，分别给予健康人血清（对照组）、透析（透析组）和非透析（非透析组）尿毒症血清孵育。茜素红S钙沉积染色及甲氧．酚酞络合酮法检测细胞层钙盐含量。实时定量PCR、荧光定量法及WeStem印迹分别检测骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、骨桥蛋白（OPN）和骨形成蛋白2（BMP2）基因以及蛋白表达。结果血清生化检测结果显示尿毒症血清较健康对照存在高磷、高脂、高全段甲状旁腺激素（iPTH）、高C反应蛋白（CRP）、自细胞介素6（IL-6）和低胎球蛋白A（P〈0．05），而透析组血清的三酰甘油、CRP、IL-6较非透析组血清高（P〈0．05）。与健康对照组相比，透析组和非透析组尿毒症血清均使HUASMC钙盐沉积更显著，BAP、OPN以及BMP2的表达上调（P〈0．05），且透析组血清作用更明显。结论尿毒症血清体外能够诱导HUASMC成骨样转化和钙化，提示可能和尿毒症相关的血管钙化有关。透析并发的微炎性反应状态可能加速了这一过程。
- 孙明妹郭永平张敏芳顾乐怡戴慧莉钱家麒
- 关键词：尿毒症血清肌细胞平滑肌脐动脉血管钙化
- 慢性肾衰竭患者血清骨保护素浓度与心脏瓣膜钙化的关系被引量：5
- 2007年
- 目的探讨慢性肾衰竭（CRF）患者血清骨保护素（OPG）水平与心脏瓣膜钙化的关系。方法以75例CRF患者[非透析组（ND）25例,腹透组（PD）28例,血透组（HD）22例1和10例健康人（对照组）为研究对象,采用酶联免疫复合物法测定患者血清OPG水平,分析其与心脏瓣膜钙化之间的关系。结果各组CRF患者血清中OPG水平[ND组（4.77±1.74）μg/L、PD组（5.22±1.57）μg/L、HD组（5.35±1.72）μg/L]显著高于对照组[（2.04±0.57）μg/L,P〈0.01]。OPG水平与年龄（r=0.311,P〈0.05）和C反应蛋白水平（r=0.353,P〈0.01）呈正相关。根据有无心脏瓣膜钙化分组后发现,存在瓣膜钙化的CRF患者OPG水平较无瓣膜钙化组显著升高[（6.28±1.66）μg/L比（4.59±1.40）μg/L,P〈0.01]。Logistic回归分析显示血清OPG水平是CRF患者心脏瓣膜钙化发生的一项独立危险因素（P〈0.01）。结论在CRF患者中,血清OPG水平与心脏瓣膜钙化相关。
- 张敏芳钱家麒徐筱琪戴慧莉吴青伟倪兆慧
- 关键词：骨保护素瓣膜钙化
- 人脐动脉平滑肌细胞体外培养被引量：9
- 2007年
- 目的建立人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法。方法运用植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养。倒置相差显微镜和免疫荧光染色方法对培养细胞进行鉴定。结果原代和传代培养的细胞生长良好,光镜下细胞呈长梭形"峰-谷"样生长,具有典型的平滑肌细胞特征。经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变;经考马斯亮兰R250及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色检测,证实为平滑肌细胞。结论植块贴壁法可成功进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养,传代后细胞生物学特征稳定,为慢性肾病并发心血管疾病的机制研究奠定了实验基础。
- 郭永平张敏芳袁江姿戴慧莉钱家麒
- 关键词：血管平滑肌细胞细胞培养脐动脉
- 体外培养的人脐动脉平滑肌细胞可自发成骨细胞分化并钙化被引量：3
- 2008年
- 研究脐动脉来源的平滑肌细胞在体外培养时是否会自发成骨细胞分化,以深入了解该细胞的生物学特点。采用MTT法研究了脐动脉平滑肌细胞的生长曲线;用形态学方法观察了脐动脉平滑肌细胞自发细胞结节的形成过程;用Hoechst 33258染色法及TUNEL染色法研究了细胞结节中的凋亡现象;采用免疫组化染色法研究了细胞结节中碱性磷酸酶的表达。采用茜素红S染色及透射电镜研究了脐动脉平滑肌细胞的自发钙化。研究发现,体外培养的脐动脉平滑肌细胞传代后约7天细胞即可汇合,汇合后的细胞表现为典型的"峰、谷"样生长状态,随着培养时间的延长,在"峰"形生长区域,细胞聚集生长,自发形成细胞结节,经4-5周培养,细胞结节不断增大并钙化,免疫组化发现结节中有大量碱性磷酸酶表达。同时,在结节形成过程中伴随有大量平滑肌细胞凋亡。我们的研究表明,体外培养的脐动脉来源的平滑肌细胞同主动脉来源的平滑肌细胞一样可以自发成骨细胞分化,而平滑肌细胞凋亡可能参与了该过程。
- 郭永平孙明姝钱家麒倪兆慧
- 关键词：血管平滑肌细胞成骨细胞分化血管钙化脐动脉
- 慢性肾衰竭与血管钙化被引量：8
- 2007年
- 钱家麒张敏芳
- 关键词：心血管钙化慢性肾衰竭终末期肾衰竭钙磷代谢紊乱粥样硬化斑块总病死率
