山东省自然科学基金(ZR2012CQ012)
- 作品数：17 被引量：64H指数：4
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- 猪伪狂犬病毒gD蛋白的截短表达与PPA-ELISA抗体检测方法的建立被引量：1
- 2014年
- 为建立一种快速的猪伪狂犬病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的PRV SA株基因组序列,PCR扩增了长约1 070bp的gD基因片段,将目的片段定向克隆到pET30a原核表达载体,转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组gD蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,建立了检测猪伪狂犬病毒抗体的PPA-ELISA检测方法。该方法与其他7种常见猪病病毒(CSFV、PPV、PRRSV、JEV、PCV-2、PEDV、TGEV)的阳性血清不发生交叉反应;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与IDEXX gD-ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为92.0%、95.1%和88.1%。本研究建立的PRV gD-PPA-ELISA抗体检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV的免疫猪群抗体监测、快速诊断和PRV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。
- 祖立闯沈志强郭广君王金良苗立中董林吕素芳
- 关键词：猪伪狂犬病毒截短表达
- PRV SA株gB基因和EGFP基因在BHK细胞中的融合表达研究
- 2019年
- 为了研究gB蛋白在细胞内的作用位点,试验以猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)SA株为模板,设计特异性引物,扩增gB基因保守片段;以pEGFP-N1质粒为模板扩增EGFP基因;以gB基因与EGFP基因胶回收产物为模板,用gB基因上游引物及EGFP基因下游引物通过重叠延伸PCR(SOE PCR)技术获得gB/EGFP融合基因;构建pcDNA3.1/gB/EGFP重组表达质粒,转染乳仓鼠肾细胞(BHK细胞),采用Western-blot技术及荧光显微镜检测荧光蛋白在细胞内的表达情况。结果表明:试验成功扩增到300bp的gB基因、760bp的EGFP基因及1060bp的gB/EGFP融合基因;成功构建出pcDNA3.1/gB/EGFP重组表达质粒并转染BHK细胞;Western-blot技术及荧光显微镜检测显示,融合蛋白在BHK细胞中成功表达。说明通过荧光蛋白研究目的蛋白的作用位点是可行的。
- 韩强郭广君吕素芳沈志强
- 关键词：作用位点
- 地塞米松促进伪狂犬病毒SA738株诱导牛肾细胞凋亡被引量：1
- 2015年
- 为研究地塞米松能否促进PRVSA738株诱导牛肾细胞的凋亡,本试验以牛肾细胞为模型,PRVSA738做为诱导剂,并添加地塞米松,病毒增殖后,采用荧光染色、DNA梯谱的方法,观察细胞发生凋亡时的形态学和生化特征,以此确定地塞米松能否促进伪狂犬病毒SA738株诱导牛肾细胞的凋亡。结果显示,PRVSA738能诱导牛肾细胞发生凋亡,同时100μmol/L的地塞米松能促进PRVSA738株诱导牛肾细胞的凋亡。为研究PRV潜伏感染的机理提供参考。
- 魏凤郭广君吕素芳王金良管宇张文通肖跃强沈志强
- 关键词：地塞米松伪狂犬病毒凋亡
- 伪狂犬病病毒疫苗株SA738侵染BHK-21细胞诱导其凋亡及Caspase3表达情况分析被引量：2
- 2017年
- 旨在深入了解猪伪狂犬病病毒疫苗株PRV SA738侵染BHK-21细胞后,诱导细胞凋亡,细胞凋亡的时间及相关细胞凋亡因子表达情况。通过测定传统疫苗毒株Bartha-K61株和实验室人工筛选的gI-/gE-/PRV SA738病毒株滴度,分别利用2株疫苗毒株侵染BHK-21,采用原位双荧光染色法检测细胞凋亡,用分光光度法测定细胞凋亡因子Caspase-3表达情况。结果表明,低剂量gI-/gE-/PRV SA738疫苗毒株和Bartha-K61疫苗毒株均延迟侵染细胞的凋亡。缺失疫苗毒株gI-/gE-/PRV SA738延迟侵染细胞的凋亡时间比Bartha-K61疫苗毒株时间长,但侵染细胞增殖速度下降。细胞凋亡后期最终细胞死亡,正常细胞细胞死亡后无凋亡小体。gI-/gE-/PRV SA738疫苗毒株和Bartha-K61疫苗毒株侵染细胞凋亡后期凋亡小体形成,并检测到膜结构。在病毒侵染早期细胞内关键凋亡细胞因子Caspase3表现为上调。Caspase-3参与了病毒侵染过程中细胞凋亡的调控。
- 郭广君吕素芳魏凤魏凤李峰肖跃强李峰
- 关键词：伪狂犬病病毒
- 细胞凋亡体外检测方法的研究进展被引量：2
- 2015年
- 细胞凋亡贯穿于生物体生命活动的全部过程,在生命活动中具有重要的地位,是生命科学领域研究的热点。目前,用于检测细胞凋亡的方法很多。为了准确、快速地检测细胞凋亡,文章在介绍细胞凋亡的形态变化和生化特征、刺激细胞凋亡发生机制的基础上重点综述了常用的细胞凋亡的体外检测方法。
- 魏凤郭广君吕素芳肖跃强张文通管宇王金良沈志强
- 关键词：细胞凋亡体外
- 猪伪狂犬病病毒 gE-/gI-/TK-多基因缺失活疫苗对猪的安全性与免疫效力研究被引量：19
- 2014年
- 为了研制猪伪狂犬病病毒三基因缺失疫苗,本试验在前期工作的基础上,将TK基因缺失的质粒pBTK与gI-/gE-PRV SA738病毒基因组共转染BHK21细胞,通过蚀斑法进行筛选。用鉴定成功的重组病毒制备活疫苗,分别接种新生仔猪及妊娠母猪,观察仔猪、妊娠母猪产仔数及仔猪健康情况,并进行抗体中和试验和攻毒保护试验。同时与双基因缺失株gI-/gE-/PRV和PRV Bartha k61做对比,以生理盐水做对照。结果成功筛选到重组病毒,命名为gI-/gE-/TK-/PRV SA738,TCID50为5.75~6.125。重组病毒制备的活疫苗,对仔猪和妊娠母猪健康状况均无影响,安全性好,免疫保护率为100%(5/5),有效诱导了机体的保护性免疫应答。结果表明,gI-/gE-/TK-PRV SA738突变株适合作为疫苗毒株使用。
- 吕素芳郭广君魏凤王文秀董炳梅毕研丽苗立中沈志强
- 关键词：伪狂犬病病毒安全性免疫效力
- 猪圆环病毒2型基因型鉴别PCR检测方法的建立被引量：5
- 2013年
- 采用PCR方法从猪圆环病毒2型（PCV2）山东分离株中扩增ORF2基因片段,结合GenBank中已登录的PCV2基因序列进行同源性分析及基因型鉴定,确定山东省PCV2的流行优势基因型,探讨PCV2基因的遗传变异特性。依据PCV2基因型间的差异性序列,设计、合成特异性PCR引物,建立PCV2基因型鉴别PCR检测方法,并从敏感性、特异性、重复性等方面评价其性能。结果,获得了28株PCV2ORF2完整基因,其中4株为PCV2a型,21株为PCV2b型,3株为新基因型PCV2d型,显示山东省流行的PCV2优势基因型为PCV2b。基因同源性分析表明,2000-2012年国内不同地区分离株的基因同源性为90.5%~99.8%,不同基因型PCV2存在一定形式的特有氨基酸位点序列。用建立的PCV2基因型鉴别PCR方法扩增的片段大小分别为341bp和177bp,该方法最低能检测病毒DNA的量为5ng/μL;特异性试验结果显示,该方法只对PCV2a和PCV2b的DNA扩增阳性,而对猪圆环病毒1型（PCV1）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）、乙型脑炎病毒（JEV）和大肠杆菌（Escherichia coli）的扩增结果均为阴性;重复检测10次的结果均一致。结果表明,建立的PCR方法具有良好的特异性和重复性,可用于PCV2基因型的鉴别检测。
- 董林王艳萍唐娜沈志强柳增善
- 关键词：猪圆环病毒2型基因型特异性PCR
- 伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株的生物学特性被引量：3
- 2014年
- 为了解gE和gI双基因缺失株伪狂犬病病毒gE-/gI-PRV SA738和野毒株PRV-SA的生物学特性,对该病毒进行了理化特性和体外增殖曲线的研究。结果显示:该缺失株对氯仿、酸、热及冻融次数敏感,从双基因缺失毒株与野毒株在BHK-21细胞上的增殖曲线来看,在病毒培养50h之前野毒株的毒价均高于缺失株,而在50h以后缺失株的毒价又高于野毒株,并且在36h时2株病毒的毒价均达到最高峰。
- 魏凤郭广君吕素芳张文通王金良董炳梅沈志强
- 关键词：伪狂犬病病毒GI基因缺失生物学特性
- 猪原代神经细胞的体外培养与鉴定被引量：1
- 2016年
- 为建立猪原代神经细胞体外培养及鉴定方法，本研究选取90日龄潜江黑猪1头，分离猪脑组织，无菌剪碎后采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备神经细胞悬液，进行培养，逐日在倒置相差显微镜下观察，并用间接免疫荧光鉴定。结果显示，培养72h后细胞全部贴壁，并长出突起，随时间增加，突起变长并交错呈网络，培养至15～20d神经细胞状态最佳，随后逐渐老化，神经细胞可生长30d，经鉴定Nestin表达呈阳性。本研究建立的方法适合一般实验室开展猪原代神经细胞的培养与初步鉴定。
- 魏凤郭广君吕素芳管宇王金良肖跃强张文通沈志强
- 关键词：神经细胞
- 核酸疫苗上游生产工艺探讨被引量：2
- 2014年
- 核酸疫苗为科研人员在疾病预防控制方面开辟了新的途径,然而目前大规模制备既符合相关质量要求,又经济的重组质粒DNA,特别是药品级重组质粒DNA,仍是制约核酸疫苗和基因治疗研究的瓶颈。如何获得合格的药用质粒DNA并建立大规模生产平台成为一个重要的研究课题,论文综述了近年来核酸疫苗上游生产工艺的技术进展,以供参考。
- 付强郭广君程立坤苗立中张松林沈志强
- 关键词：核酸疫苗质粒发酵分批补料培养
