国家自然科学基金(30871868)
- 作品数：15 被引量：43H指数：4
- 相关作者：李玉峰姜平王先炜王兴龙白娟更多>>
- 相关机构：南京农业大学南京晓庄学院河北农业大学更多>>
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- 我国华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株NSP2基因的遗传变异分析被引量：3
- 2011年
- 为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在我国华东地区的遗传变异情况和发展趋势,本研究对2004年～2009年分离鉴定的38株PRRSV流行株NSP2基因高变异区进行序列测定及分析。38株PRRSV分离株核苷酸同源性为71.6%～99.6%,推导的氨基酸同源性为63.7%～98.3%,共分为5种基因缺失类型。系统进化分析表明:38个分离株按基因序列可分为NSP2基因亚型Ⅰ和Ⅱ,其中,28株属于NSP2基因亚型Ⅰ,各病毒株均具有至少30个氨基酸的缺失,基因同源性为92.9%～99.2%;10株属于NSP2基因亚型Ⅱ,均具有1个或不具有氨基酸的缺失,基因同源性为76.5%～99.6%。流行株显示由基因亚型Ⅱ逐渐向基因亚型Ⅰ变异的趋势,并且NSP2核苷酸的缺失数量呈上升趋势。由此显示,我国PRRSV流行株NSP2基因变异较大,并不断出现新的变化,因此,加强PRRSV流行株基因变异的监测十分必要。
- 王兴龙李玉峰周业飞王先炜姜平
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒流行病学调查NSP2基因
- 猪IL-10的原核表达及其单克隆抗体的制备被引量：2
- 2010年
- 为了制备猪IL-10的单克隆抗体(MAb),本研究根据GenBank登录的猪白细胞介素10(PIL-10)基因序列设计两对特异性引物,利用套式PCR扩增PIL-10成熟蛋白编码基因(490bp),构建原核表达载体pET28a-PIL-10,并转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE和western blot分析鉴定,证明PIL-10重组蛋白获得表达。提取纯化该重组蛋白包涵体,免疫BALB/c小鼠,经过3次细胞融合,间接ELISA方法筛选,获得一株能稳定分泌抗猪IL-10MAb的杂交瘤细胞,将其命名为2F4。Western blot结果证明该MAb能够与重组蛋白发生特异性反应。间接ELISA测定细胞上清抗体效价为1∶1024,腹水效价为1∶128000,该MAb为IgG3亚型,轻链为λ型。杂交瘤细胞连续传代20代,分泌抗体的效价基本一致,从而为进一步建立猪IL-10的检测方法奠定了物质基础。
- 刘婷婷王兴龙李玉峰宋艳华张国龙姜平
- 关键词：原核表达单克隆抗体
- 育肥猪呼吸道疾病综合征病理学观察和病原学检测被引量：4
- 2011年
- 猪呼吸道疾病综合征是一种由病毒、细菌、环境应激和猪体免疫力低下等多因素相互作用引起的呼吸道疾病。2009年2～4月,上海农场某猪场一批育肥猪出现疑似病例,表现为食欲下降,咳嗽,呼吸困难,生长缓慢和料肉比降低。本研究在流行病学调查的基础上,剖检8头病猪观察其病理变化,主要表现为肺脏弥慢性实变,弹性降低,间质增宽,有的水肿、气肿,或纤维素性胸膜肺炎。病原检测结果显示,该发病猪群主要病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌。本研究为猪呼吸道疾病综合征的防治提供了依据。
- 刘捷李玉峰王先炜李文良姜平
- 关键词：猪呼吸道疾病综合征病理学观察病原
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因不同变异毒株对仔猪致病性研究被引量：1
- 2011年
- 为了评价猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)不同分离毒株致病性差异,选择4株PRRSV分离毒株,即YX0907、BB0907、SY0909(属于NSP2基因亚型Ⅰ,具有30aa缺失特征)和NT0801(属于NSP2基因亚型Ⅱ,其NSP2上不存在缺失)进行动物接种试验。将23头45日龄PRRSV、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌阴性健康仔猪随机分为5组,第1～4组各5头猪,分别颈部肌内注射上述4株PRRSV分离株(均为第3代)2×104.32TCID50.(mL.头)-1,第5组3头猪作为空白对照,隔离饲养21d,每天观察临床症状。攻毒后不同时间测定病毒血症,并对死亡猪和第21天处死猪进行病理剖解、观察大体病理变化和组织病理变化。结果显示,BB0907毒株毒力最强,试验猪感染后体温明显升高,临床症状明显,可引起3/5死亡,病猪肺脏组织具有明显病理变化;YX0907毒株毒力较强,试验猪临床症状和病理变化明显,可引起2/5死亡;NT0801毒力较弱,部分试验猪感染后出现1～2d体温升高和轻度临床症状,未引起死亡;SY0909毒株毒力最弱,感染猪出现1～3d体温升高,临床症状不明显,病理变化较轻;而对照猪无临床异常表现和病理变化。该研究结果表明,PRRSV分离株毒力存在明显差异,具有NSP2相同基因缺失类型的3个PRRSV分离株毒力差异较大,PRRSV毒力与NSP2 30aa基因缺失没有直接联系。
- 王兴龙周业飞李玉峰李治军王先炜姜平
- 关键词：PRRSVNSP2毒力
- 猪Toll样受体3、7和8基因的克隆与序列分析被引量：2
- 2010年
- 为了对猪Toll样受体(TLR)3、7和8基因进行克隆与序列分析,本实验从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中,利用RT-PCR方法分片段扩增猪TLR3、7、8基因,并克隆于pMD18-T载体中。根据测序结果分析,猪TLR3、7和8基因的ORF分别为2718bp、3153bp和3087bp,并分别编码906、1051和1029个氨基酸。同源性分析结果显示,它们与GenBank中登录的猪TLR的相应序列同源性达99%以上;与牛、马、羊和人的同源性较高,与鼠的同源性次之,与鸡的同源性最低,其蛋白分子结构预测表明猪TLR3、7、8均为跨膜蛋白。
- 张莉莉白娟王先炜李玉峰王兴龙姜平
- 关键词：TLR克隆
- 1株抗欧洲型和美洲型PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定被引量：2
- 2010年
- 利用RT-PCR方法扩增出欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SS-6毒株的核衣壳(N)蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建了重组表达质粒pGEX-N,并将其转化到大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的诱导下获得高效表达,重组蛋白的分子量约为40 ku。用纯化的重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体。经细胞融合获得一株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,命名为1 B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgG1型,其轻链为κ链;间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应;ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:640,腹水的效价为1:256 000,为猪繁殖与呼吸综合征的诊断奠定了基础。
- 王晓丰李玉峰王先炜王海燕姜平
- 关键词：PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体NUCLEOCAPSID间接免疫荧光试验免疫印迹试验
- 猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立被引量：2
- 2009年
- 根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。
- 白娟李广明宋勤叶李玉峰王先炜张国龙姜平
- 关键词：猪脑心肌炎病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 我国猪繁殖与呼吸综合征病毒NT0801分离株分子特征
- 2011年
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前引起国内外养猪业严重经济损失的重要病原之一,病毒基因和毒力变异较大。PRRSV NT0801株分离自我国发病猪群,毒力较强,但NSP2基因不存在高致病性PRRSV 30个氨基酸的缺失。为了进一步阐明该分离株的分子特征,本研究对该毒株全基因序列进行了测定和分析,结果该毒株基因组全长15 439 bp,其中包含29 nt Poly(A)。与高致病性PRRSV毒株JXA1比较,核酸序列同源性为96.7%,推导的GP3和GP5氨基酸序列同源性分别为97.2%和98.5%,但NSP2基因无30个氨基酸的缺失;与传统型毒株ch-1a比较,推导的GP3和GP5氨基酸序列同源性分别为92.9%和91.5%;基因进化树分析结果显示其介于高致病性和传统PRRSV毒株之间。与其它不同毒力PRRSV分离株基因序列比较,未发现明显重组信号。不同毒力毒株氨基酸残基比对分析结果显示,15个位点潜在毒力相关氨基酸残基中,该毒株有9个与高致病性PRRSV毒株一致,3个与高致病性PRRSV毒株不同,但与传统型和JXA1疫苗株相同,1个位点只与JXA1疫苗株相同,2个与其它毒株都不相同。表明该分离株与高致病性PRRSV密切相关,PRRSV流行毒株变异与基因突变有关,从而为该病毒毒力基因定位研究奠定了基础。
- 陆琪王兴龙宋艳华李玉峰白娟姜平
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒分子特征
- 猪脑心肌炎病毒NJ08株基因组序列测定与分析被引量：10
- 2011年
- 为测定猪源脑心肌炎病毒(EMCV)NJ08分离株全基因序列,本研究应用RT-PCR方法分5个基因片段扩增NJ08分离株的基因组,同时应用3'-RACE和5'-RACE技术扩增3'-UTR和5'-UTR,分别克隆于pMD18-T载体中进行测序,获得EMCVNJ08株全基因组cDNA序列,并将全基因组及其推导的氨基酸序列与GenBank中登录的国内外参考病毒株进行同源性比较及系统进化分析。结果表明:EMCVNJ08分离株基因组全长7724bp;属于Ia亚群;与GXLC、GX0602、BJC3、HB1等国内分离株以及BEL-2887A、CBNU、K3、K11、EMCV-R、PV21等国外分离株同源性达99%以上;EMCV流行株的非结构蛋白中3D最为保守,2A变异最大,结构蛋白中VP2最为保守,VP1变异最大。本研究丰富了我国EMCV分子流行病学资料。
- 白娟蒋康富李玉峰王先炜姜平
- 关键词：脑心肌炎病毒基因组
- 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP1蛋白重组腺病毒的构建及其对小鼠的免疫抑制作用
- 2011年
- 利用RT-PCR扩增获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SY0608株非结构蛋白基因NSP1,将其克隆至穿梭载体pShuttle-CMV,经PmeⅠ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,获得重组腺病毒载体,再经PacⅠ线性化后转染至HEK-293A细胞,获得重组腺病毒,IFA和Western-blot鉴定结果证明其可以表达NSP1。将该重组腺病毒2次接种ICR小鼠,每次间隔2周,于免疫后不同时间取脾淋巴细胞进行体外培养,用于淋巴细胞增殖试验,并用ELISA检测IFN-γ和IL-10水平。结果显示,与野生型腺病毒(wtAd)或DMEM对照组相比,重组腺病毒rAd-NSP1组T淋巴细胞增殖指数(SI)和IFN-γ水平显著降低,IL-10水平明显增高(P<0.05)。结果表明,高致病性PRRSV NSP1蛋白具有明显的免疫抑制作用。
- 周业飞李玉峰王先炜姜平
- 关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒重组腺病毒IFN-Γ
