国家自然科学基金(30360100)
- 作品数：6 被引量：11H指数：2
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- 抗人乙酰胆碱受体scFv-人血清白蛋白融合蛋白的构建及在大肠杆菌中的表达被引量：10
- 2006年
- 目的:制备抗人乙酰胆碱受体单链抗体637(scFv637)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,提高scFv637的稳定性。方法:用PCR扩增人HSA基因,并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体scFv637基因的载体pHEN2中构建重组载体pHEN2-scFv637-HSA。以重组载体转化E.coliHB2151,表达产物用斑点杂交试验检测,并以SDS-PAGE和Westernblot鉴定其融合蛋白的相对分子质量(Mr)。结果:琼脂糖凝胶电泳显示,扩增的人HSA基因和融合基因的大小分别为1770bp和7054bp。构建的scFv637-HSA经测序证实核苷酸序列正确,并且正确克隆至载体的开放读码框架内。表达产物仅存在于pHEN2-scFv637-HSA转化的E.coliHB2151外周质裂解液中。表达的融合蛋白的Mr约为95900。结论:在E.coli中成功地表达scFv637-HSA融合蛋白,为进一步对其进行功能研究和应用奠定了基础。
- 范华英孟繁平齐栋魏晶李强李英信李红花
- 关键词：重症肌无力乙酰胆碱受体单链抗体融合蛋白
- 重症肌无力致病性自身抗体的人工构建被引量：2
- 2006年
- 目的构建一株具有致病性的人抗乙酰胆碱受体(AchR)自身抗体,用于诱导猴实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)模型。方法将分离自重症肌无力(MG)患者胸腺的抗AchR抗体的抗原结合片段(Fab637)克隆至含有免疫球蛋白(IgG1)基因的载体pIgG1,构建能在哺乳类细胞表达完整IgG1类抗AchR抗体(IgG1-637)的重组表达载体(pIgG1-637),将pIgG1-637转染CHO-k1细胞系,筛选出稳定表达IgG1-637的细胞株扩大培养。将纯化的IgG1-637注射5只恒河猴,通过检查猴肌肉收缩强度和复合肌肉运动电位(CMAP),判定猴EAMG发病情况,从而鉴定IgG1-637的致病性。结果20μmol／L MSX(L-methionine sulfoxmine)选择的CHO-k1细胞表达最高水平的抗体IgG1-637,表达产量为17．4μg/ml。3只猴(分别接受1．7、1．7和5．0mg／kg的注射剂量)在注射IgG1-637后1周内出现肌肉收缩无力临床症状,并表现出CMAP减弱现象。结论由Fab637构建的完整的IgG1-637是一株致病性抗AchR抗体,可在猴诱导出EAMG。
- 杨康鹃孟繁平魏晶李强李红花李英信M.StassenM.de Baets
- 关键词：乙酰胆碱受体自身抗体重症肌无力
- 人源性抗乙酰胆碱受体自身抗体的构建及特异性鉴定
- 2007年
- 目的用人抗乙酰胆碱受体(AchR)自身抗体的抗原结合片段(Fab)构建完整的抗人AchR自身抗体,为重症肌无力(MG)的实验研究提供人源性抗体材料。方法应用PCR技术从分离自MG患者胸腺的Fab637扩增重链Fd片段基因和轻链基因,并克隆至含有免疫球蛋白(IgG1)基因的载体pIgG1上,构建人源性抗AchR自身抗体哺乳类细胞表达的重组载体pIgG1-637。将pIgG1-637转染CHO-k1细胞,细胞培养上清液经斑点杂交试验检测抗体的表达,以放射免疫测定法测定表达的抗体与特异性人AchR结合的活性。结果细胞培养24h后能检测到抗体的分泌,表达的抗体能特异性地与抗原结合,且结合活性很高。结论已成功地构建了具有与抗原特异性结合的人源性IgG1类抗人AchR自身抗体IgG1-637。
- 杨康鹃孟繁平金桂花李芳芳孙昌元金权鑫M.StassenM.de Baets
- 关键词：乙酰胆碱受体重症肌无力自身抗体
- 抗人乙酰胆碱受体单链抗体融合人血清白蛋白基因的构建
- 2004年
- [目的 ]提高抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体 (ScFv)的稳定性 ,构建单链抗体 人血清白蛋白 (HSA)融合基因 .[方法 ]应用聚合酶链反应扩增人血清白蛋白基因 ,并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体单链抗体 (ScFv6 37)的载体pHEN 2 (pHEN 2 ScFv6 37)上 .将重组质粒 pHEN 2 ScFv6 37 HSA转化至大肠杆菌 (E .coliDH 5α)中 ,分离提纯重组质粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认融合基因的正确性 .[结果 ]电泳检查发现了大小分别为 1770bp和 70 5 4bp的人血清白蛋白基因和融合基因 ,且发现位置正确 .[结论 ]成功地构建了单链抗体ScFv6 37与人血清白蛋白融合基因 .
- 范华英齐栋李辉金桂花李红花魏成淑李英信孟繁平
- 关键词：重症肌无力单链抗体人血清白蛋白融合基因
- 抗乙酰胆碱受体单链抗体的纯化
- 2004年
- [目的 ]纯化抗乙酰胆碱受体单链抗体 ,为测定其特异性准备材料 .[方法 ]将大肠杆菌表达的单链抗体 (含有 6xHis及c myc标记肽 )经Ni nitrilotriaceticacid(Ni NTA)纯化 ,以十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳和应用鼠抗c myc单克隆抗体的免疫印迹试验鉴定纯化产物 ,并根据吸光度值测定表达产物的含量 .[结果 ]在纯化产物中发现大小约为 36KD的单链抗体 ,杂质蛋白带较少 ,表达量约为30 μg/L .[结论 ]用Ni NTA纯化带有 6xHis标记肽的单链抗体的方法简单、纯度高 ,以大肠杆菌表达抗乙酰胆碱受体单链抗体时产量低 .
- 杨康鹃孟繁平de Baets M.
- 关键词：抗体受体胆碱能纯化
- 单链抗体融合蛋白的构建及应用被引量：1
- 2005年
- 通过重组DNA技术将单链抗体(scFv)基因与其他效应蛋白基因融合在一起,经表达后可以得到具有scFv特性和所融合的效应蛋白活性的scFv融合蛋白。这种融合蛋白已应用于许多领域的研究中,并已显示出较高的价值。本文就scFv融合蛋白的构建和应用做一综述。
- 范华英孟繁平
- 关键词：单链抗体融合蛋白重组DNA技术疾病诊断疾病治疗
