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HCV胞膜蛋白E2基因的融合表达、纯化及多克隆抗体制备: 2005年; 目的原核表达HCV胞膜蛋白E2,获得抗E2多克隆抗体。方法利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出831bp(384～661aa)的E2基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导HCVE2蛋白表达,SDS-PAGE和WesternBlot法检测蛋白表达,Ni-NTA偶联的琼脂糖吸附柱纯化融合蛋白,薄层扫描及Bradford法检测纯化蛋白的纯度>90%;用表达的E2蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法检测抗体效价,WesternBlot法检测抗体特异性。结果用原核诱导表达出HCV胞膜蛋白E2免疫新西兰兔后获得多克隆抗体的效价在1∶1280以上,能特异性识别E2蛋白。结论成功构建HCVE2基因的原核表达载体,利用原核表达HCV胞膜蛋白E2制备的多克隆抗体能特异性识别E2蛋白。为进一步开展HCVE2蛋白功能和HCV受体的研究奠定了基础。; 杜德伟孙脊峰杨洁贾战生秦鸿雁周永兴韩骅; 关键词：肝炎病毒金属螯合亲和层析多克隆抗体

丙型肝炎病毒E1E2蛋白原核表达载体的构建及表达产物的鉴定: 2004年; 目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)包膜糖蛋白 (E1E2 )基因的原核表达载体 ,为研究HCVE1E2蛋白属性及基因免疫奠定基础。方法 :设计HCVE1E2区基因上、下游引物 ,分别引入BglⅡ及EcoRI酶切位点 ,以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/HCV1- 30 11为模板 ,通过PCR扩增获得HCVE1E2区基因片段 ,将其克隆入原核表达载体pRSETA ,然后通过酶切和序列测定对其进行鉴定 ;将此表达载体转化入表达菌BL2 1(DE3)pLySs诱导表达 ,并采用SDS -PAGE对表达产物进行鉴定。结果 :经酶切及序列测定分析表明 ,成功地构建了重组原核表达载体pRSETA -HCVE1E2 ;SDS -PAGE显示目的蛋白大量表达 ,且呈非溶状态。结论 :HCVE1E2融合蛋白可以在大肠杆菌中大量表达 ,为HCVE1E2蛋白的制备及基因疫苗的研制奠定了基础。; 刘秋平李光玉杜德伟潘蕾魏欣贾战生; 关键词：丙型肝炎病毒包膜糖蛋白基因表达

CD81介导丙型肝炎病毒入胞作用的研究: 2006年; 丙型肝炎病毒（HCV）感染呈全球分布，全世界约有1．7亿HCV感染者，占世界人口的3％，是人类免疫缺陷病毒-1感染者的5倍。约70％HCV感染者转化为慢性，并与肝硬化、肝衰竭和肝癌的发生密切相关。迄今为止，对于HCV的嗜肝性尚无合理解释，参与HCV识别、黏附及入胞的肝细胞表面分子还不完全清楚。CD81属于四次跨膜超家族成员，能够与HCV包膜糖蛋白E2结合，有学者认为其可能是HCV的特异性受体。为验证CD81介导HCV包膜蛋白及HCV颗粒入胞能力，我们构建含人CD81基因及HCV包膜蛋白E2661与人IgG1-hcγ1融合蛋白的真核表达载体并进行真核表达。将HCV包膜蛋白或HCV阳性血清与稳定表达CD81的细胞株共同孵育，检测细胞内HCV包膜蛋白及HCV的mRNA，观察了CD81介导HCV包膜蛋白及HCV颗粒入胞能力。; 贾战生杜德伟刘秋平王春雨秦鸿雁魏欣赵甫涛李光玉韩骅; 关键词：包膜糖蛋白

pcDNA3.1-CD81载体在人肝癌细胞中的表达及意义被引量：1: 2005年; 目的　研究人白细胞分化抗原CD81真核表达载体pcDNA 3 .1 CD81在人肝癌细胞系HepG2 中的表达及意义。方法　由人Molt 4细胞提取细胞总RNA ,根据已公布的序列设计引物 ,运用RT PCR及PCR方法扩增出人CD81基因 ,应用TA克隆插入PMD 18T载体 ;定向克隆入真核表达载体pcDNA 3 .1(+ ) ;通过脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2 ,用免疫组织化学方法 (ABC法 )及流式细胞技术检测目的蛋白的表达。结果　由RT PCR及PCR方法扩增出人CD81编码基因与Genebank公布的序列完全一致。重组真核表达载体pcDNA 3 .1 CD81经酶切和PCR鉴定分析正确。免疫组织化学方法 (ABC法 )及流式细胞技术证明转染的HepG2 细胞表面能有效地表达CD81蛋白。结论　所构建的pcDNA3 .1 CD81真核表达载体在HepG2 细胞有良好的表达 ,该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供细胞模型 ,为研究丙型肝炎病毒 (HCV)与CD81相互作用奠定基础。; 刘秋平贾战生; 关键词：CD81 人肝癌细胞 PCDNA3 T载体 MOLT-4 定向克隆

融合His标签的HCV包膜糖蛋白E2的真核表达及意义被引量：1: 2004年; 目的　构建HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合的真核表达载体并在CHO细胞中表达 ,为研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定基础。方法　利用PCR技术从HCV基因组序列中扩增出编码HCV包膜糖蛋白E2的基因 ,将其插入原核表达载体pET2 8(a)载体中 ,构建pET2 8(a) HCVE2 ,从pET2 8(a) HCVE2上获得His HCVE2融合基因 ,插入pcDNA3 1,构建表达HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合蛋白的真核表达载体pcDNA3 1 His E2。用脂质体介导法将pcDNA3 1 His E2转染CHO细胞 ,通过间接免疫荧光、Westernblot检测融合蛋白在CHO细胞内的表达。结果　转染HCVE2与His融合基因的真核表达载体的CHO细胞内有融合蛋白的表达。结论　与His标签融合的HCV包膜糖蛋白E2能够在CHO细胞内表达。; 杜德伟贾战生秦鸿雁孙强刘秋平聂青和周永兴韩骅; 关键词：融合基因真核表达

HCV E1/E2-Fc融合基因真核载体的构建及表达产物的鉴定: 2004年; 目的构建表达HCV包膜糖蛋白 E1+E2661及E2661与人IgG Fc融合蛋白的真核表达载体并在COS-7中表达E1+E2661及E2661与人IgG Fc的融合蛋白,为研究HCV包膜糖蛋白的功能及其与细胞表面受体相互作用奠定基础。方法利用PCR 方法从HCV基因组序列中扩增出编码HCV包膜糖蛋白El+E2661及E2661的基因,再将两段基因片段亚克隆到含有人IgG Fc基因的Pblue-scriptⅡSK-hc γ1载体中,获取El+E2661及E2661与hc γ1的融合基因并插入真核表达载体pEF BOSneo,构建表达HCV E1+E2661及E2661与 hc γ1的融合蛋白的真核表达载体;用脂质体介导转染COS-7细胞;RT-PCR检测COS-7细胞内融合基因,直接免疫荧光、ELISA、Western blot检测COS-7细胞培养上清及细胞内融合蛋白的表达。结果DNA测序结果证实插入片段即是HCV E1+E2661及E2661与HC γ1的融合基因;直接免疫荧光、ELISA、Western blot均检测到融合蛋白的表达。结论 pEF BOSHCV E1+E2661/Fc pEF—BOSHCV E2661/Fc真核表达载体构建成功,并能够在COS-7细胞中表达分泌性有活性的融合蛋白。; 杜德伟贾战生秦鸿雁刘秋平周永兴韩骅; 关键词：HCV

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国家自然科学基金(30070687)