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基于RNA-seq数据大规模开发中华蜜蜂幼虫的SSR分子标记被引量：17: 2017年; 中华蜜蜂是东方蜜蜂的一个亚种,也是我国的特有蜂种。本研究基于已获得的中华蜜蜂幼虫肠道转录组数据预测SSR分子标记,并进行SSR位点的信息分析和SSR引物的发掘。利用MISA软件对幼虫肠道转录组中数据组装得到的43557条unigenes进行搜索,共预测出13448个SSR位点,它们分布于7763条unigene中,其中最主要的重复类型为二核苷酸重复(58.03%),其次为三核苷酸重复(28.23%)和四核苷酸重复(9.72%)。二核苷酸重复中的基序主要是AT/AT(占总量的30.4%)。对于所有的SSR位点,利用Primer Premier 5软件成功设计出21627对引物,随机选取48对引物对5个不同来源的中华蜜蜂幼虫肠道样品进行SSR位点扩增,共有15对成功扩增出符合预期的目的片段。研究结果表明利用转录组数据大规模开发中华蜜蜂幼虫的SSR引物是可行的,本研究开发出的SSR引物为研究中华蜜蜂分子遗传学奠定了基础。; 熊翠玲张璐付中民王鸿权侯志贤童新宇李汶东郑燕珍陈大福郭睿; 关键词：RNA-SEQ 中华蜜蜂 SSR分子标记

胁迫意大利蜜蜂幼虫肠道的球囊菌的转录组分析被引量：25: 2017年; 【目的】本研究旨在通过趋势分析对胁迫意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)幼虫肠道的球囊菌Ascosphaera apis的差异表达基因(DEGs)进行转录组分析。【方法】将纯化的球囊菌孢子配制为1×107孢子/m L的饲料饲喂意蜂3日龄幼虫,利用Illumina Hi Seq 2500平台对球囊菌胁迫的意蜂幼虫肠道c DNA进行测序,将过滤得到的有效读段(clean reads)映射(mapping)到核糖体数据库及意蜂参考基因组,最后将未映射上的reads映射到本课题组组装并注释的球囊菌参考转录组。利用STEM软件对DEGs进行趋势分析。利用WEGO软件对显著表达模式中的DEGs进行GO富集分析。利用Blastall对显著表达模式中的DEGs进行KEGG代谢通路富集分析。最后,通过对随机选取的6个DEGs进行RT-q PCR分析,对RNA-seq数据进行验证。【结果】球囊菌胁迫意蜂幼虫肠道样品的Illumina测序共得到球囊菌的25 454 076条原始读段(raw reads),经过滤得到24 909 820条clean reads,Q30均在93.46%以上。趋势分析结果显示,19 893个DEGs聚类为8个表达模式,其中有12 151个DEGs聚类为3个表现为显著上调趋势的表达模式。GO富集分析结果显示,表现上调趋势的DEGs富集在40个GO term,富集基因数最多的为细胞进程(cellular process)(2 601 unigenes),其次为代谢进程(metabolic process)(2 553 unigenes)和细胞(cell)(2 522unigenes)。KEGG代谢通路富集分析结果显示,上调趋势中的DEGs富集在119个代谢通路上,其中富集基因数最多的是核糖体(ribosome)(213 unigenes),其次为氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)(154 unigenes)和内质网蛋白加工(protein processing in endoplasmic reticulum)(130unigenes)。共有48个DEGs富集在MAPK信号通路上,聚类分析结果显示,这些DEGs随着胁迫时间的延长表达水平逐渐增强。RT-q PCR结果显示,6个DEGs的表达水平变化趋势与RNA-seq数据一致,证明了本研究中的转录组数据真实可靠。【结论】本研�; 陈大福郭睿熊翠玲梁勤郑燕珍徐细建黄枳腱张曌楠张璐李汶东童新宇席伟军; 关键词：意大利蜜蜂 RNA-SEQ 差异表达基因

分子技术在蜜蜂白垩病病原鉴定和诊断上的应用被引量：1: 2009年; 蜜蜂白垩病是一种由球囊菌属(Ascosphaera)的真菌寄生而引起蜜蜂幼虫死亡的传染性疾病,对蜂群的群势发展影响极大,近几年又呈现出大面积爆发的趋势。但目前对于该病的诊断和病原鉴定多依赖于典型症状,方法极不可靠。本文介绍了可用于分子鉴定和诊断的的研究基础,探讨利用球囊菌属的各病原rDNA的ITS1-5.8S-ITS2序列资料,分别设计出高特异性引物,用PCR技术扩增出可用于鉴定病原物种的分子标记,从而构建一套快速、准确诊断该病的分子技术。; 熊翠玲陈大福; 关键词：蜜蜂白垩病病原

基于RNA-seq数据大规模挖掘蜜蜂球囊菌的SSR分子标记被引量：5: 2017年; 基于已获得的球囊菌转录组数据预测微卫星标记(SSR),并进行SSR位点的信息分析和SSR引物的挖掘.利用软件MISA对球囊菌转录组中42610条unigenes进行搜索,共预测出7968个SSRs,分布于5233条unigenes中,其中最主要的重复类型为三核苷酸重复(53.15%),其次为二核苷酸重复(32.32%)和四核苷酸重复(8.46%).二核苷酸重复中的基序主要是AG/CT(占总量的15.8%).针对所有的SSR位点,利用Primer Premier 5软件设计出6956对SSR特异性引物,随机选取20对引物对两个不同来源的球囊菌样品进行SSR位点扩增,共有6对引物成功扩增出符合预期的目的片段.研究结果表明,利用球囊菌转录组数据开发SSR引物是可行的.; 李汶东熊翠玲王鸿权侯志贤童新宇张璐付中民郑燕珍陈大福郭睿; 关键词：蜜蜂球囊菌微卫星标记转录组 RNA-SEQ

球囊菌胁迫中华蜜蜂幼虫肠道过程中病原的转录组学研究被引量：18: 2017年; 【目的】本研究利用RNA-seq技术对球囊菌胁迫的中华蜜蜂(中蜂)幼虫肠道进行深度测序,经趋势分析得到差异表达基因(DEGs)的显著表达模式,进而对胁迫过程中的球囊菌进行转录组学分析。【方法】利用Illumina HiSeq 2500平台对球囊菌胁迫的中蜂幼虫肠道进行深度测序,并利用相关软件进行了深入分析。最后,通过RT-qPCR对RNA-seq数据进行了验证。【结果】本研究共得到球囊菌的41133932条高质量clean reads。22865个DEGs共聚类为8个基因表达模式,其中,16769个DEGs聚类为2个显著上调趋势与2个显著下调趋势。GO富集分析结果显示,显著上调与显著下调趋势中的DEGs分别富集于40与37个GO term,基因富集数最多的为细胞进程(2486 unigenes)。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果显示,显著上调与显著下调趋势中的DEGs分别富集于119和112个pathway,基因富集数最多的分别是氨基酸生物合成(127 unigenes)与核糖体(98 unigenes)。进一步分析表明球囊菌在胁迫中蜂幼虫肠道的过程中通过提高物质合成促进其增殖,而宿主通过抑制球囊菌的蛋白合成抵御病原入侵。富集在MAPK信号通路的11个DEGs的表达水平随着胁迫时间的延长而逐渐下降,推测中蜂幼虫通过抑制该通路而阻遏球囊菌增殖。【结论】本研究不仅为揭示白垩病过程中的球囊菌-中蜂幼虫互作提供了重要信息,也为阐明不同抗性蜂种的球囊菌抗性差异奠定了基础。; 郭睿陈大福黄枳腱梁勤熊翠玲徐细建郑燕珍张曌楠解彦玲童新宇侯志贤江亮亮刀晨; 关键词：中华蜜蜂转录组

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌早期胁迫的转录组学被引量：13: 2017年; 【目的】白垩病是困扰养蜂生产的顽疾。目前,尚无利用二代测序技术研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对健康(Ac CK)及球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫的中蜂4日龄幼虫肠道(Ac T)进行深度测序,在转录组水平研究中蜂幼虫在球囊菌胁迫早期的胁迫应答。【方法】通过Illumina Hi Seq 2500平台对Ac CK和Ac T进行双端(PE125)测序,首先对测序数据进行质控和评估,利用edge R软件进行差异表达基因(DEG)分析,进而对DEGs进行GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析,最后,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Ac CK和Ac T的转录组测序共得到188 457 338条原始读段(raw reads),经过滤得到182 088 448条有效读段(clean reads),两端Q20与Q30均在97.96%和94.97%以上,说明测序数据质量良好;主成分分析(PCA)结果显示第一与第二主成分可分别解释基因表达总体差异的75.8%和10.7%;DEG分析结果显示上调基因与下调基因的数量分别为344和239个;GO富集分析结果显示DEGs共富集在36个GO分类(term)上,其中基因富集数最多的细胞(106 unigenes)、细胞组件(106 unigenes)和代谢进程(104 unigenes);KEGG代谢通路富集分析结果显示上调与下调基因分别富集在72个和45个代谢通路上,其中上调基因富集数最多的是核糖体(72 unigenes)、碳代谢(16 unigenes)和糖酵解(14 unigenes),而下调基因富集数最多的是碳代谢(9 unigenes)、二羧酸代谢(8 unigenes)和氨基酸生物合成(7 unigenes),进一步分析表明中蜂幼虫肠道的部分细胞免疫对球囊菌的胁迫产生应答,而体液免疫不产生应答,宿主的代谢相关基因受到球囊菌的显著抑制。【结论】揭示了中蜂幼虫在球囊菌入侵早期的胁迫应答,为深入解析中蜂幼虫的胁迫应答机制提供了重要信息,也为在分子水平研究关键应答基因打下了基础。; 陈大福郭睿熊翠玲梁勤郑燕珍徐细建张曌楠黄枳腱张璐王鸿权解彦玲童新宇; 关键词：中华蜜蜂转录组 RNA-SEQ

意大利蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌早期胁迫的转录组学分析被引量：3: 2017年; 【目的】球囊菌特异性地侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病,该病造成成年蜜蜂数量的大幅下降,从而严重影响蜂蜜等产品的产量。目前,尚无利用二代测序技术研究白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对正常及球囊菌胁迫后的意大利蜜蜂4日龄幼虫肠道进行深度测序,为解析宿主响应球囊菌胁迫的应答机制提供了重要的参考信息。【方法】利用Illumina Hiseq2500平台对对照组(AmCK)和处理组(AmT)幼虫肠道进行双端(PE125)测序;利用Perl脚本进行下机数据过滤;利用R软件进行测序饱和度分析、计算各样品之间的相关性系数;利用SOAP aligner/soap2软件将未比对上核糖体的读段(Reads)比对到意大利蜜蜂参考基因组;基于GO数据库和KEGG数据库进行GO分类和KEGG代谢通路(Pathway)富集分析。【结果】RNA-seq共得到181 096 194条原始读段(Raw reads),经过滤得到179078764条有效读段(Clean reads)。差异表达基因(DEGs)分析结果显示上调与下调基因的数量分别为4和20个。DEG的基因本体论(Gene ontology,GO)分析结果显示,这些DEGs分布于10个GO分类,除归入结合(Binding)的基因和催化活性(Catalytic activity)的部分基因外,绝大多数GO分类上的基因均表现为下调。DEGs的KEGG代谢通路分析结果显示各有1个DEG分别富集在核糖体和氧化磷酸化且均下调表达。【结论】本研究揭示了意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌入侵早期的胁迫应答,为解析宿主响应球囊菌胁迫的应答机制奠定了基础。; 郭睿熊翠玲郑燕珍张璐童新宇梁勤陈大福; 关键词：意大利蜜蜂

蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)检测分子标记的灵敏性测定: 蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是蜜蜂白垩病的重要病原物,传统的鉴定方法是以形态学、生物学、培养条件等方面的特征为基础的,这些特征差异并不明显,给以形态学特征来鉴定Ascosphaera属下各种的工作带来不...; 陈大福熊翠玲付中民马晓云梁勤; 关键词：蜜蜂白垩病蜜蜂球囊菌分子标记灵敏性 PCR; 文献传递

蜜蜂球囊菌检测分子标记的灵敏性测定被引量：3: 2010年; 蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是蜜蜂白垩病的重要病原物,传统的鉴定方法是以形态学、生物学、培养条件等方面的特征为基础,这些特征差异并不明显,给以形态学特征来鉴定Ascosphaera属下各种的工作带来不可逾越的困难。A.apis检测分子标记可以用于准确检测该病原物。本研究利用该检测分子标记,结合PCR技术,分别检测不同浓度的A.apisDNA溶液,以测定该检测分子标记的灵敏性。试验结果表明,A.apis检测分子标记的最低检测DNA模板浓度为1.74×10-7ng/μl,即在25μl的PCR反应体系中加入4.34×10-6ng的A.apis的DNA样品,检测结果即可呈阳性,初步测定该检测分子标记具有较高的灵敏性。本研究为下一步利用该分子标记构建一套以PCR为基础的快速、可靠的检测方法以及应用于蜜蜂白垩病的快速诊断奠定基础。; 熊翠玲陈大福付中民马晓云梁勤; 关键词：蜜蜂白垩病蜜蜂球囊菌分子标记灵敏性 PCR

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国家自然科学基金(30800806)

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