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广西壮族自治区科技攻关计划(0626001-5-1): 作品数：11 被引量：30H指数：4; 相关作者：谢志勤谢芝勋刘加波谢丽基庞耀珊更多>>; 相关机构：广西兽医研究所广西壮族自治区疾病预防控制中心广西大学更多>>; 发文基金：广西壮族自治区科技攻关计划国家百千万人才工程广西特聘专家专项经费资助项目更多>>; 相关领域：农业科学生物学医药卫生经济管理更多>>

四种方法检测广西奶水牛结核病的比较被引量：3: 2010年; 应用牛结核菌素对奶水牛进行牛结核病皮内变态反应的检测,然后对皮内变态反应阳性牛采样进行分离培养、γ-干扰素ELISA和聚合酶链反应检测,比较这四种检测方法的符合率。结果共对1850头奶水牛进行皮内变态反应检测,皮内变态反应阳性的奶水牛有78头,从78头反应阳性的奶水牛中分离鉴定为牛分枝杆菌的有2份,γ-干扰素ELISA方法检测为牛分枝杆菌阳性的有5份,PCR方法鉴定阳性的有4份;阳性检出率以变态反应为最高78/1850(4.21%),γ-干扰素ELISA方法为5/78(0.27%),PCR检测方法为4/78(0.21%),而分离培养为最低2/78(0.105%)。变态反应与分离鉴定的符合率最低,为0.105%;γ-干扰素ELISA方法、PCR方法与分离鉴定的符合率较接近,分别为40%和50%。γ-干扰素ELISA检测方法和PCR检测方法具有较好的特异性,可以作为变态反应检测的补充。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基温娟蓝如束张振荣黄海强; 关键词：牛结核病变态反应聚合酶链反应

广西奶水牛结核病三种检测方法的比较被引量：2: 2011年; 应用牛结核变态反应、PCR和分离培养3种方法,对奶水牛进行牛结核病检测,比较3种检测方法的符合率。结果表明,1850头奶水牛中有78头奶水牛的皮内变态反应结果为阳性,而对变态反应阳性的牛样品进行PCR检测和分离鉴定,分别鉴定出4份和2份牛分枝杆菌。阳性检出率以变态反应为最高(4.22%),PCR和分离鉴定的较低,分别为0.21%和0.11%。变态反应与PCR检测、分离鉴定的符合率较差,而PCR检测与分离鉴定的符合率相对较接近。因此建议,在对奶水牛群进行结核病检测时,应先以变态反应检疫牛群,再结合PCR检测进行综合诊断,更有利于奶水牛结核病的检测与净化。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基温娟张振荣黄海强; 关键词：奶水牛牛结核病变态反应 PCR检测

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌二重实时荧光PCR检测方法的建立被引量：4: 2010年; 根据结核分枝杆菌23SrRNA基因序列和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计了2对针对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示,该方法特异性好,能区分不同模板浓度组合的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;可检测到10copies模板的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;对保存的50份PPD检测阳性牛的鼻黏液、牛乳和淋巴结进行检测,结果6份结核分枝杆菌阳性,1份牛分枝杆菌阳性,其余均为阴性,与PCR的检测结果一致。由此可见,建立的二重实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、可定量检测等优点,适合用于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的鉴别检测。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基蓝如束张振荣黄海强; 关键词：结核分枝杆菌牛分枝杆菌

牛分枝杆菌CFP-10基因的表达和重组蛋白的纯化被引量：1: 2012年; 根据GenBank中牛分枝杆菌的基因序列,设计合成一对扩增CFP-10基因完整ORF的特异性引物,以pET32a(+)为载体构建重组表达载体CFP-10/pET32a(+)。重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.9mmol/L IPTG37℃诱导3h后表达,收集菌体并裂解,裂解后上清和沉淀经SDS-PAGE分析,结果表明融合蛋白分子量分别为30kD,表达产物以可溶性存在于上清中,后经Ni-NTA吸附柱方法对目的蛋白进行纯化,经薄层凝胶扫描分析,纯化后的His融合蛋白纯度达95%,该CFP-10表达蛋白可作为体外诊断抗原,为进一步建立检测牛分枝杆菌的方法奠定基础。; 谢志勤谢芝勋邓显文谢丽基庞耀珊刘加波范晴; 关键词：牛分枝杆菌纯化

牛分支杆菌广西分离株Hsp 65基因的克隆及序列分析被引量：1: 2010年; 利用牛分支杆菌Hsp 65基因特异性引物,对2株牛分支杆菌广西分离菌株进行PCR扩增,产物经纯化后与载体pMD-18连接,然后转染大肠埃希菌DH5α。提取转染后大肠埃希菌的质粒进行双酶切和PCR鉴定,鉴定为阳性的质粒进行序列测定。测序后通过序列分析软件DNA Star MegAlign对Hsp 65基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,并与GenBank上已发表的牛分支杆菌的Hsp 65基因进行比较。结果显示,广西分离株mt359、mt370与已发表的7株参考株序列,其核苷酸序列同源性在98.7%～100%之间,推导的氨基酸序列同源性在98.4%～100%之间。表明广西分离的菌株与参考的其他牛分支杆菌菌株的Hsp 65基因差异不大,说明牛分支杆菌分泌蛋白Hsp 65基因十分保守,从而为检测跟踪菌株的变异,研制牛分支杆菌亚单位基因疫苗奠定基础。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基温娟张振荣黄海强; 关键词：牛分支杆菌 HSP 聚合酶链反应

牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：9: 2012年; 【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基彭宜范晴牟群莫文胜; 关键词：牛结核病牛分枝杆菌 SYBR

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测试剂盒的研究被引量：4: 2010年; 根据已发表的结核分枝杆菌23S rRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了2对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,并研制出检测试剂盒。结果表明,该检测试剂盒对结核分枝杆菌能特异性地扩增出838 bp条带而扩增不出631 bp条带,牛分枝杆菌能特异地扩增出838 bp和631 bp条带,而对其他牛菌株的DNA扩增结果均为阴性;敏感性试验表明最低能检测出50 pg的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌DNA模板;保存期测定结果表明,在-20℃条件下保存至1、3、6、9个月时,试剂盒的敏感性无明显变化,仍能检测到50 pg的DNA模板,保存至12个月时其敏感度仍能100%检出阳性样品。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基温娟蓝如束张振荣黄海强; 关键词：结核分枝杆菌牛分枝杆菌二重PCR 试剂盒

环介导等温可视扩增检测牛分枝杆菌方法的建立被引量：2: 2011年; 目的:建立一种快速简便检测牛分枝杆菌的方法。方法:根据已发表的牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成6对特异扩增牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,通过条件优化,建立针对牛分枝杆菌的环介导等温扩增(LAMP)检测法,测定其特异性和敏感性,并对采集的牛临床样品的DNA分别进行检测。结果:采用该法只检出牛分枝杆菌,检测的最低拷贝数为1×102拷贝/μL。结论:建立的LAMP方法简便、快速、特异性高,可用于临床上牛分枝杆菌的快速检测。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基彭宜范晴; 关键词：牛分枝杆菌环介导等温扩增

牛分枝杆菌广西分离株CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的克隆与序列分析被引量：4: 2009年; 根据GenBank上牛分枝杆菌(M.bovis)CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定及分析,结果显示,可以从广西分离株MBT359扩增出大小与预期相符的基因片段,经测序证实,扩增出的片段即为3个目的基因片段。序列分析表明,广西分离株MBT359的CFP-10、ESAT-6、MPB70基因片段与国际标准强毒株AF2122/97相应基因核苷酸同源性为100%。该研究结果为广西牛分枝杆菌流行株主要基因测序、建立广西牛结核病流行株遗传多态性数据库奠定了基础。; 雷剑明谢芝勋谢志勤刘加波庞耀珊邓显文谢丽基; 关键词：牛分枝杆菌 CFP-10 ESAT-6 MPB70

牛分枝杆菌广西分离株ESAT-6基因鉴定及遗传进化分析被引量：2: 2010年; 根据GenBank中牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)的ESAT-6基因序列(No:BX248347)设计1对引物,PCR扩增获得2株牛分枝杆菌广西分离株(mt359、mt370),纯化产物与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,对经双酶切和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序及同源性比较分析。结果表明,牛分枝杆菌广西分离株mt359、mt370与GenBank中已发表的6株毒株(5株结核分枝杆菌和1株牛分枝杆菌)的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为100.0%,与牛分枝杆菌标准株C680001的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为96.6%。说明致病性牛分枝杆菌的ESAT-6基因十分保守,不存在种间差异。; 谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基温娟张振荣黄海强; 关键词：牛分枝杆菌广西分离株同源性

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