浙江省自然科学基金(Y2100909)
- 作品数：6 被引量：11H指数：2
- 相关作者：薛向阳张丽芳田晓娟沈贤陈向敏更多>>
- 相关机构：温州医科大学黄石市爱康医院更多>>
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- HCMV-UL138 CTL表位肽重组酵母菌的构建及其免疫效应被引量：1
- 2015年
- 目的:以乙肝病毒表面抗原为载体,制备含人巨细胞病毒(HCMV)-UL138 CTL表位肽的重组酵母菌并分析其免疫效应。方法:根据蛋白质数据库获得HCMV-UL138氨基酸序列,综合应用SYFPEITHI、NetCTL及HLA-Bind方法筛选富含CTL表位的UL138多肽,插入到乙肝表面抗原前S2(Pre S2)1-9区末端再与HBsAg序列连接,在不改变氨基酸密码的前提下,根据酵母偏爱密码子优化序列,进行全序列合成,克隆入pPIC3.5K酵母载体,构建pPIC3.5K/Pre S2-HBsAg-UL13815-27重组质粒。重组质粒经Bgl I处理线性化后,电转化至GS115菌株中,构建Pre S2-HBsAg-UL13815-27重组酵母,阳性整合菌株经甲醇诱导后,通过Western blot及ELISA方法鉴定目的蛋白表达。鉴定的重组酵母菌经灭活后,全菌体皮下免疫BALB/c小鼠,通过ELISA法检测HBsAg特异性血清Ig G抗体;UL13815-27 CTL表位肽(VMLVLIVAILCYL)刺激免疫小鼠的脾细胞,通过检测IFN-γ表达分析诱导产生的CTL反应。结果:PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3.5K/Pre S2-HBsAg-UL13815-27重组质粒。重组酵母经甲醇诱导后,酵母裂解液中可检测到HBsAg特异性抗体识别的、分子量约33 kD目的蛋白。表达Pre S2-HBsAg-UL13815-27灭活全菌体免疫小鼠后,可检测到HBsAg特异性抗体,免疫小鼠脾细胞经UL13815-27 CTL表位肽刺激,IFN-γ表达水平比对照组明显升高。结论:重组酵母全菌体成功表达了Pre S2-HBsAg-UL13815-27重组蛋白,且重组酵母菌全菌体免疫小鼠可诱导产生UL13815-27特异性的细胞免疫。
- 张跃进柳献云陈向敏田晓娟李文姝薛向阳
- 关键词：人类巨细胞病毒CTL表位乙肝病毒表面抗原
- 系统性红斑狼疮患者外周血人巨细胞病毒感染状态分析及意义被引量：3
- 2014年
- 目的检测SLE患者外周血人巨细胞病毒（HCMV）的感染状况，探讨HCMV感染在SLE发病中的作用。方法采集并抽提60例已确诊的SLE患者和111名健康人外周血白细胞DNA，利用巢式PCR技术检测HCMV糖蛋白gB（UL55）基因以确定HCMV感染情况。应用2个独立样本t检验、非参数检验、χ2检验及Fisher确切概率法统计分析。结果琼脂糖凝胶电泳及测序显示建立的巢式PCR能特异地检测HCMV．UL55基因，SLE患者外周血中HCMV检出率明显高于对照组[分别为41．7％（25／60）和1．8％（2／111），χ2=46．551，P〈0．01]。与外周血HCMV阴性组SLE患者相比，HCMV阳性组SLE患者抗核糖体P蛋白抗体（Rib．P）阳性率[分别为26％（9／35），56％（14／25），χ2=5．659，P=0．017]、直接Coomb’s试验阳性率[分别为37％（13／35），72％（18／25），χ2=7．096，P=-0．008]及抗β2糖蛋白1（GP1）抗体水平[分别为21．3（9．9，51．8）U/ml，13．6（5．9，23．1）U／ml；U=2．017，P=0．044]明显升高，血液系统相关指标中的红细胞[分别为（3．65±0．10）×10^12／L，（3．17±0．17）×10^12／L；t=2．574，P=0．013]、淋巴细胞[分别为（1．37±0．14）×10^12／L，（0．90±0．13）×10^12；t=2．456，P=0．017]、血红蛋白[分别为（110±19）g／L，（98±5）g／L；t=2．034，P=0．048]明显减少；肾损害相关指标中的血尿阳性率[分别为40％（14／35），72％（18／25）；χ2=6．000，P=0．014]、尿蛋白定量（24h）水平[分别为0．80（0．53，2．37）g，0．48（0．13，1．21）g；U=2．140，P=0．032]明显上升。结论外周血细胞HCMV感染可能参与SLE发生、发展过程。
- 陈静熊江彪叶文静朱小春章慧娣张丽芳薛向阳
- 关键词：巨细胞病毒聚合酶链反应
- 胃癌组织中人巨细胞病毒感染及其临床意义被引量：5
- 2014年
- 目的:初步探讨人巨细胞病毒(HCMV)感染与胃癌的关系。方法:采用化学发光(CLIA)法对胃癌组(n=80)及健康对照组(n=80)的外周血清进行HCMV Ig G、Ig M抗体检测;巢式PCR技术检测22例胃癌患者的肿瘤及癌旁正常胃黏膜组织标本中的HCMV UL55基因;统计分析HCMV感染与胃癌临床特征的关系。结果:胃癌组血清HCMV-Ig G阳性率为95%(76/80),HCMV-Ig M阳性率为6.25%(5/80);在健康对照组血清中,HCMV-Ig G阳性率为97.5%(78/80),HCMV-Ig M阳性率为3.75%(3/80),HCMV Ig G、Ig M在胃癌组与健康对照组血清中差异无统计学意义(P>0.05)。HCMV UL55阳性检出率在22例胃癌组织中为50%(11/22),在相应正常胃黏膜组织中为9.09%(2/22),胃癌组织HCMV阳性检出率较癌旁正常组织显著升高(P<0.01)。此外,未发现HCMV感染与胃癌的TMN分期、组织病理分化及肿块大小有显著性关联。结论:胃癌组织中存在HCMV感染,且HCMV相较于癌旁正常组织更倾向感染癌灶,提示HCMV感染可能参与胃癌的发生发展过程。
- 金劲激涂建欣吴明马海广沈贤薛向阳
- 关键词：胃肿瘤人巨细胞病毒
- 表达乙型肝炎表面抗原及前 S2蛋白120～146片段重组酵母菌的构建及全菌体免疫效应评价被引量：2
- 2014年
- 目的：构建表达 HBsAg 及前 S2蛋白120～146片段（PreS2120-146）-HBsAg 的重组酵母菌，并评价其全菌体免疫效应。方法根据酵母密码子偏爱性优化 PreS2120-146区及 HBsAg 基因序列，串联后克隆到毕赤酵母 pPIC3．5K 表达载体，构建 pPIC3．5K／PreS2120-146-HBsAg 质粒，重组质粒经 BgkⅡ酶切线性化后，电转化至 GS115菌株中，筛选 PreS2120-146-HBsAg 重组毕赤酵母，通过 SDS-PAGE、Western 印迹、ELISA 分析目的蛋白的表达；以表达目的蛋白的灭活酵母全菌体免疫 BALB／c 小鼠，采用 ELISA 检测其产生的 HBsAg 特异性抗体；以 HBsAg CTL 表位肽刺激免疫小鼠脾细胞，通过实时PCR 检测γ干扰素表达，分析其诱导的 CTL 反应。采用独立样本 t 检验。结果PCR、酶切和测序分析表明成功构建了 pPIC3．5K／PreS2120-146-HBsAg 重组质粒。重组毕赤酵母甲醇诱导后，SDS-PAGE、Werstern 印迹和 ELISA 证实 PreS2120-146-HBsAg 目的蛋白表达。与 HBsAg 纯抗原免疫比较，灭活重组酵母菌免疫小鼠产生抗 HBsAg 特异性 IgG 抗体水平相当（t＝0．946，P ＝0．381）。CTL 反应检测显示， HBsAg CTL 表位肽刺激灭活重组酵母菌免疫组小鼠的脾细胞产生更高水平的γ干扰素（t＝2．305，P ＝0．044）。结论利用整合型重组毕赤酵母表达系统成功表达了 PreS2120-146-HBsAg 目的蛋白，全菌体免疫小鼠后能诱导产生特异的体液免疫和细胞免疫反应。
- 陈向敏张跃进田晓娟夏平潘唯文夏天俞陈慧张丽芳薛向阳
- 关键词：PRES2毕赤酵母免疫反应
- HCMV潜伏相关UL138基因重组腺病毒的构建及其对THP-1单核细胞功能的影响
- 2016年
- 目的：构建含人巨细胞病毒（ HCMV）潜伏相关 UL138基因的重组腺病毒,探讨UL138基因对THP-1单核细胞功能的影响。方法构建携带UL138基因的重组腺病毒,利用TCID50法确定重组腺病毒滴度。重组腺病毒以不同MOI比值感染THP-1细胞,通过绿色荧光蛋白表达确定感染THP-1细胞最佳MOI值；定量PCR分析UL138表达对THP-1细胞前炎症细胞因子表达变化,通过定量PCR芯片分析趋化因子及受体的表达变化。结果成功构建了携带UL138基因的重组腺病毒,TCID50法测定病毒的滴度达1x1011 PFU/ml。利用重组腺病毒携带的绿色荧光蛋白表达检测THP-1细胞的感染率,结果显示,重组腺病毒以MOI=1∶100感染THP-1细胞,感染率为60%, RT-PCR和Western blot证实了THP-1细胞能够表达UL138,且随着时间的延长,蛋白表达量逐渐增多。定量PCR检测发现,THP-1细胞 UL138过表达后,可明显抑制IL-18、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等前炎性细胞因子的表达。定量PCR芯片分析显示,UL138表达明显改变THP-1单核细胞内趋化因子及受体的表达,除外 CCL17、CCL21、CCL22、XCL2等趋化因子以及 CCR2、CXCR1、CXCR2、 CXCR4及CX3CR1等趋化因子受体在不同时间点上调表达外, CXCL1、CXCL3、CXCL9、CXCL10、CXCL11等大部分趋化因子及受体的表达均显著减少。结论成功构建了可感染THP-1单核细胞的UL138基因重组腺病毒；THP-1单核细胞过表达UL138可明显影响其功能。
- 郭刚强陈静陈文静叶璐璐孙祥威张良章慧娣林巧爱沈贤张丽芳薛向阳
- 关键词：人巨细胞病毒重组腺病毒THP-1
- HPV16 L1在整合型重组毕赤酵母中的表达及病毒样颗粒的纯化
- 2014年
- 目的构建可稳定表达HPV16L1的整合型重组毕赤酵母,并纯化自主组装成的HPV16L1病毒样颗粒(VLPs)。方法根据酵母密码子偏爱性优化HPV16L1基因并克隆到pPIC3.5K表达载体,构建pPIC3.5K/HPV16L1重组质粒;重组质粒经Bgl II酶切线性化后,电转化至GS115菌株中,筛选HPV16L1重组毕赤酵母。阳性整合菌株甲醇诱导后,以HPV16L1单克隆抗体检测目的蛋白表达;采用肝素亲和层析法纯化HPV16L1VLPs并进行透射电镜观察。结果PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3.5K/HPV16L1重组质粒。成功构建的HPV16L1重组毕赤酵母甲醇诱导后,Western blot证实重组酵母菌裂解产物存在HPV16L1目的蛋白。肝素亲和纯化后,透射电镜观察到了直径大约55nm的VLPs,其形态与HPV16天然病毒颗粒相似。结论利用整合型重组毕赤酵母表达系统成功表达了HPV16L1蛋白,并用肝素亲和纯化可快速获得结构完整的HPV16L1VLPs,为HPV16预防性疫苗的研制奠定基础。
- 田晓娟冯娟张丽芳李文姝薛向阳
- 关键词：毕赤酵母表达系统病毒样颗粒
