国家教育部博士点基金(20040487077)
- 作品数：12 被引量：9H指数：2
- 相关作者：陈实谢林王璐陈刚尹注增更多>>
- 相关机构：华中科技大学湖北省农业科学院中国科学院更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
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- 建立同种大鼠心脏移植超急性排斥反应动物模型被引量：2
- 2006年
- 目的建立大鼠心脏移植超急性排斥反应的实验动物模型。方法以BN大鼠为供者,Lewis大鼠为受者。供、受者间连续进行3次皮肤移植,使受者预致敏。再进行颈部异位心脏移植。采用微量淋巴毒试验监测受者体内抗供者抗体滴度的变化。结果预致敏后的受者体内抗供者抗体滴度明显升高。7只受者心脏移植后有6只移植心在24h内被排斥,病理学证实为超急性排斥反应。结论供、受者间连续3次皮肤移植预致敏后,再行心脏移植可以建立稳定的同种移植超急性排斥反应模型。
- 李荣郭晖王大卫谢林曾梦华王树森王璐陈实
- 关键词：心脏移植动物移植物排斥
- 猪Sertoli细胞在异种移植模型中对人免疫细胞功能的影响被引量：1
- 2008年
- 目的通过体外实验,研究猪睾丸支持细胞Sertoli细胞对猪-人异种移植模型中人外周血单个核细胞(PB-MCs)功能的影响,以探讨Sertoli细胞在诱导异种移植免疫耐受中的潜在作用。方法采用改良酶消化法获取新生猪睾丸Sertoli细胞,纯化后培养,检测分离的原代猪Sertoli细胞纯度,并在光学显微镜和电子显微镜下对猪Sertoli细胞进行形态学测定。采集新鲜人血液,分离外周血单个核细胞(PBMCs),将原代猪Sertoli细胞与人PBMCs共同孵育,观察Sertoli细胞对人PBMCs凋亡率的影响,并与人PBMCs自身凋亡率进行比较。在体外,用3H-TdR摄入法检测人PB-MCs的增殖,对照组用刀豆蛋白A(ConA)刺激活化人PBMCs,实验组则将猪原代Sertoli细胞与ConA活化的人PB-MCs共同培养,连续4d检测人PBMCs的增殖变化。结果采用该实验改良法分离的新生猪Sertoli细胞,经检测纯度超过93%。光学显微镜及电子显微镜下均可见Sertoli细胞胞体多突起、胞核内多核仁、胞质内多脂滴等典型特征。经Annexin-Ⅴ/PI染色,流式细胞仪检测,猪Sertoli细胞可诱导人PBMCs凋亡率升高(8.92±1.75)%,高于人PBMCs的自身凋亡率(3.09±0.75)%(P<0.01)。并且猪Sertoli细胞能够延迟ConA刺激的人PBMCs体外增殖峰的出现(对照组增殖峰在第2天出现,实验组增殖峰在第3天出现),但是两组增殖峰峰值间的差异没有统计学意义。结论采用该法可以获得高纯度的猪Sertoli细胞。在猪-人异种移植体外实验中,新生猪Sertoli细胞能够诱导人PBMCs凋亡,并且能够延迟ConA活化的人PBMCs增殖反应,对人PBMCs的活化增殖有一定程度的抑制作用。
- 谢林尹注增胡枫王璐朱珉向莹陈刚陈实
- 关键词：异种移植人外周血单个核细胞
- 核糖核酸干扰技术在移植免疫中的应用前景
- 2006年
- 朱珉陈刚陈实
- 关键词：移植免疫哺乳动物细胞双链RNA靶基因表达转基因小鼠培养细胞
- 仿生学在移植免疫研究中的应用
- 2007年
- 世界正在进入仿生学时代。在生命科学领域中进行仿真学研究,将极大地促进人类对生命现象的认知,并揭示其普遍规律。运用仿生学原理在天然模型面前扬其利,避其害,将为科学工作者提供一个崭新的科研思维平台。从仿生角度洞悉并破解移植免疫奥秘将是一个具有广阔前景的创新源泉。
- 朱珉王璐谢林陈刚陈实
- 关键词：仿生学耐受
- 转人CD46基因抑制人补体在转基因小鼠心脏组织中的沉积
- 2008年
- 目的观察转人源性膜辅助蛋白（CD46）基因对转基因小鼠心脏中人补体沉积的抑制作用。方法以近交系昆明小鼠为对象，采用显微注射法制备转人CD46基因小鼠，用逆转录聚合酶链法（RT_PCR法）检测外源基因的整合情况。以F0代转基因小鼠11只为实验组，同窝非转基因小鼠10只为对照，快速切取小鼠心脏，用改良的Langendorff法经小鼠主动脉逆行灌注预先制备的含补体的B型血人血浆。观察并记录小鼠心脏搏动时间；采用免疫荧光和免疫组织化学法检测小鼠心脏组织中补体C3。及C9的沉积情况。结果Fn代转基因小鼠外源基因的整合率为33．3％。实验组小鼠心脏搏动时间为（42．6±20．6）min（15±77min），长于对照组的（20．2±12．5）min（7±40min），差异有统计学意义（P〈0．01）。实验组小鼠心脏组织中补体G3c及C9的沉积均少于对照组。结论通过显微注射法制备的转人CD46基因小鼠，其外源基因可稳定表达；转人CD46基因可以抑制人补体C3c及C9在转基因小鼠心脏组织中的沉积。
- 谢林魏庆信李文鑫王树森李荣曾梦华朱珉郭晖陈实
- 关键词：转基因异种补体小鼠
- 改良法分离睾丸支持细胞体外诱导异种淋巴细胞凋亡被引量：4
- 2007年
- 目的改进睾丸支持细胞(Sertoli 细胞)的分离方法及培养条件,探讨 Sertoli 细胞体外诱导异种淋巴细胞凋亡的作用机制。方法取2～4周龄的 SD 大鼠睾丸,采用 V 型胶原酶、胰蛋白酶及脱氧核糖核酸酶二步消化法制备 Sertoli 细胞。用免疫组织化学法(SABC 法)检测 Sertoli 细胞中Fas 配体(FasL)、转化生长因子β_1(TGF-β_1)、clusterin 的表达;流式细胞仪检测 Sertoli 细胞诱导异种淋巴细胞凋亡情况。结果在分离培养纯化过程中,Sertoli 细胞占培养细胞总数的90%以上,生长状况良好,能稳定表达 FasL、TGF-β_1和 clusterin,并且能够诱导异种淋巴细胞发生凋亡。结论应用本实验方法能够稳定获得大量高纯度的 Sertoli 细胞,并且能够发挥其免疫豁免的功能,从而用于细胞联合移植。
- 尹注增曾梦华谢林李荣黄亚冰朱珉陈刚陈实
- 关键词：淋巴细胞SERTOLI细胞改良法
- Oligofectamine介导转录因子SP1诱骗性寡核苷酸转染猪内皮细胞系条件的优化研究被引量：1
- 2007年
- 目的确定SP1诱骗性寡核苷酸(Decoy Oligodeoxynucleotides,ODNs)在Oligofectamine介导下转染猪血管内皮细胞系SV-40-PED的最佳转染条件和效果。方法以SV-40-PED为转染对象,在6孔培养板中,接种SV-40-PED细胞2×105/孔,将4μlOligofectamine和不同浓度的SP1ODNs(2.5、5.0、7.5、10.0和12.5μl)分别溶于100μl无血清、无抗生素的DMEM培养基,室温放置20min后转染细胞,SP1ODNs最终浓度分别为50、100、150、200和250nmol/L、转染26h检测不同浓度转染情况,确定最佳SP1ODNs与Oligofectamine的比率、转染时间;流式细胞仪检测细胞内的相对荧光强度及摄取率评价转染效率;荧光显微镜观察细胞内荧光分布;测定细胞上清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量,观察细胞损伤情况。结果SV-40-PED在Oligofectamine的介导下可以摄取SP1ODNs。SP1ODNs终浓度为50、100、150nmol/L组细胞形态无明显变化,终浓度为200、250nmol/L组细胞收缩、变圆后逐渐恢复;SP1ODNs终浓度为250nmol/L时,转染26h时细胞形态也无明显变化,48、72h时有细胞漂浮现象。荧光下观察,转染成功各组荧光物质分布于细胞核内,其中SP1ODNs终浓度为200、250nmol/L组可见清晰核仁,浓度越高,荧光强度越强,细胞内荧光物质主要聚集于细胞核。SP1ODNs终浓度为250nmol/L时,转染72h组LDH浓度为137.12±3.92U/L,显著高于26h的49.61±17.13U/L和48h的120.26±8.42U/L,均有统计学意义(P<0.01);当转染时间为26h时,各浓度组上清液LDH值差异无统计学意义(P>0.05)。结论SP1ODNs终浓度为250nmol/L、转染26h时可以为SV-40-PED转染提供良好效果。
- 黄亚冰徐婧陈松谢林王璐尹注增左利群陈实
- 关键词：转录因子转染
- 猪睾丸Sertoli细胞的分离、培养及其免疫豁免相关细胞因子的检测被引量：1
- 2008年
- 目的探讨猪睾丸Sermli细胞分离、培养的方法，并对其体外培养的状态及免疫豁免相关细胞因子的表达进行检测，为Sertoli细胞用于移植提供依据。方法无菌条件下取10～15日龄的湖北白猪睾丸，剥离睾丸白膜及表面血管，剪碎后用2．0g／LV型胶原酶以及2．5g／L胰蛋白酶和0．5g／L DNaseI消化（两步法）分离Sertoli细胞，于37℃、含体积分数为5％CO2的培养箱中培养。采用倒置相差显微镜观察细胞形态，透射电镜进行超微结构鉴定，流式细胞仪检测细胞体外活率，逆转录聚合酶链反应检测Sertoli细胞sox9、FasL、转化生长因子B（TGF-β）及Clusterin的表达，四甲基偶氮唑盐（MTT）检测细胞的活性。结果猪睾丸经分离、培养，所获得的Sertoli细胞纯度达90％以上。培养后的细胞凋亡率为（2．61±0．96）％，死亡率为（2．12±0．74）％；培养的Sertoli细胞稳定表达sox9、TGF-β、Clusterin，而FasL表达较弱。体外培养的Sertoli细胞可以保持良好活性达21d。结论采用V型胶原酶以及胰蛋白酶和DNaseI两步法消化分离可获得大量高纯度的Sertoli细胞，该细胞在培养过程中能够稳定表达FasL、TGF-β和Clusterin分子。
- 胡枫尹注增王璐谢林向莹徐婧陈松李俊华陈刚陈实
- 关键词：塞尔托利细胞细胞培养技术CD95
- 云南眼镜蛇毒因子用于预致敏大鼠同种心脏移植的实验研究
- 2006年
- 目的观察纯化的云南眼镜蛇毒因子（Y-CVF）对预致敏大鼠同种心脏移植急性体液排斥反应的作用。方法BN大鼠到Lewis大鼠连续3次皮肤移植预致敏后行颈部异位心脏移植。将15对大鼠用随机数字法分成2组，实验组（n=8）于心脏移植前24h静脉给予Y-CVF80μg／kg；对照组（n=7）不用Y-CVF。观察移植心的生存时间，移植心停跳后病理学检查排斥类型，免疫组织化学染色观察移植心IgG和补体C3的沉积。结果Lewis大鼠预致敏后抗BN大鼠抗体滴度由0升高至1：1028～1：2056。对照组移植心存活时间为12．71h±13．94h，实验组移植心存活时间为99．50h±38．72h，与对照组比较差异有统计学意义（t=5．599，P〈0．01）。病理检查结果证实，实验组均未发生急性体液排斥，仅见以大量单核淋巴细胞浸润为特征的急性细胞排斥反应。对照组则见以小血管内血栓形成为特征的急性体液排斥反应。免疫组织化学IgG染色实验组和对照组均为阳性，C3染色对照组为阳性，而实验组为阴性。结论使用Y-CVF可克服预致敏大鼠同种心脏移植急性体液排斥反应的发生。
- 李荣陈刚郭晖王大卫谢琳王树森王婉瑜熊郁良陈实
- 关键词：心脏移植移植排斥
- 转录因子诱骗性寡核苷酸转染猪血管内皮细胞抑制人补体介导的异种细胞毒作用
- 2008年
- 目的探讨转录因子SP，诱骗性寡核苷酸（decoyODNs）转染的猪血管内皮细胞对人血清补体介导的异种细胞毒作用的影响。方法将培养的永生化猪血管内皮细胞系细胞株SV40-PED分为3组。转染组：SV-40PED转染了SP，decoyODNs；错配组：S驴4D—PED转染了错配的decoyODNs；空转染组：SV-40PED仅用转染试剂oligofectamine作用。转染后26h，采用细胞爬片免疫荧光技术、蛋白印迹法、逆转录聚合酶链反应及乳酸脱氢酶释放试验进行检测，分别观察各组SV40-PED胞膜a半乳糖残基（regal）、蛋白质和α1，3-半乳糖基转移酶（α1，3-GT）mRNA等表达的变化，以及转染了SP，decoyODNs的SV-40PED对人血清补体介导的细胞毒作用的影响。结果转染组SV-40-PED胞膜α—G1的荧光表达明显减弱，部分胞膜可见点状荧光缺损，而空转染组和错配组仍可见明亮的绿色荧光。转染组蛋白表达水平均有不同程度的下降，相对吸光度（A值）仅为未转染组的52．6％。转染组α1，3GT基因异构体1和2mRNA的相对表达量分别为0．42±0．20和0．27±0．12，空转染组分别为0．72±0．17和0．50±0．19，两组比较，差异有统计学意义（P〈0.05）；错配组与空转染组相比，差异无统计学意义（P〉0.05）。体积分数为20％和40％的人血清对空转染组和错配组SV40-PED均有不同程度的杀伤，而对转染组SV-40-PED的杀伤明显减弱（P〈0.，05）。结论经SP，decoyODNs转染的猪血管内皮细胞可以抑制人血清补体介导的异种细胞毒作用。
- 黄亚冰王璐尹注增李荣郭晖陈实
- 关键词：转录因子SP1寡核苷酸类补体
