温州市科技计划项目(G20090142)
- 作品数：1 被引量：3H指数：1
- 相关作者：张孝任陆月刘雪荣吴小兵高基民更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心温州医学院更多>>
- 发文基金：浙江省重大科技专项基金浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目浙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备被引量：3
- 2011年
- 利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD（可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白）蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量（MOI）（0-1 000）感染BHK21c022细胞,观察比较其转导效率和细胞毒性。用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD。用rAd5-sTNFRII-gAD以不同的MOI（0~1 000）感染BHK21c022细胞,收取上清进行Western blotting分析,比较上清中sTNFRII-gAD蛋白的表达量。在此基础上,用rAd5-sTNFRII-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞,在无血清培养条件下反复多次收取培养上清,经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD融合蛋白,并体外测定该融合蛋白拮抗TNFα的活性。结果获得了携带sTNFRII-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD;用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明,随着腺病毒用量的增高,表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加;MOI在0~100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性,MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。Western blotting分析结果表明,随着腺病毒用量的增高,培养上清中sTNFRII-gAD融合蛋白表达量明显增加,以MOI为1 000时最高。在此基础上,我们用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL,每48 h收获上清1次并换液,反复6次收取培养上清共约3 L,经过纯化获得了约11 mg的sTNFRII-gAD融合蛋白。体外活性测定实验表明,获得的sTNFRII-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用。腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统,利用该系统成功制备了有生物学�
- 陆月刘丹张孝任刘雪荣沈炜郑刚柳云帆董小岩吴小兵高基民
- 关键词：腺病毒重组蛋白哺乳动物细胞
