国家自然科学基金(30871299)
- 作品数：2 被引量：4H指数：1
- 相关作者：胡延忠张军马增翼李雪丽席子明更多>>
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- Hsf4-/-小鼠晶状体永生化上皮细胞系建立的研究被引量：1
- 2013年
- 目的 建立Hsf4-/-小鼠的晶状体永生化上皮细胞系.方法 实验研究.取新生P6天的Hsf4-/-小鼠晶状体原代培养晶状体上皮细胞（MLEC）,用SV40,T-抗原转染,C418筛选建立永生化细胞系MLEC/Hsf4-/-,免疫印迹法检测α-A晶状体蛋白表达.结果 倒置相差显微镜下观察可见细胞贴壁生长,有伪足伸出,多角形,大小均匀,细胞膜边界清晰,细胞质透亮.消化后的细胞呈圆形透亮,胞质丰富.免疫印迹法检测MLEC/Hsf4-/-细胞（两个克隆）中的α-A晶状体蛋白（α-A-crystallin）有表达.转染Hsf4b蛋白后Hsp25蛋白表达上调.结论 采用组织块接种法获得小鼠晶状体上皮细胞后,转染SV40大T-抗原,G418筛选可成功建立永生化细胞系MLEC/Hsf4-/-.
- 张军马增翼王悦玲王继燕胡延忠
- 关键词：DNA结合蛋白质类细胞系免疫印迹法
- 热休克转录因子4b的克隆表达及MAP激酶P38对其磷酸化调控被引量：3
- 2010年
- 目的:构建热休克转录因子4b(Hsf4b)的真核表达载体,探讨MAP激酶P38对其磷酸化调控作用。方法:用人心脏cDNA文库为模板,应用囊括Hsf4b全长的引物进行PCR并在Hsf4b cDNA的N-端加入Flag标签。将PCR产物经KpnI和EcoRI酶切后,与该二酶线性化pcDNA3.0质粒一起连接获得重组质粒pcDNA-Flag-Hsf4b,将克隆好的pcDNA-flag-Hsf4b转染HEK293T细胞,并用抗Flag抗体进行免疫印迹分析,免疫沉淀实验和体内Pulldown实验证明Hsf4b可与MAP激酶P38结合,激酶实验结果显示P38可体外磷酸化Hsf4b。结果:应用基因克隆技术,将人Hsf4b的cDNA克隆到真核表达质粒pcDNA3.0和pEBG中。pcDNA-Flag-Hsf4b可在真核细胞HEK293T中表达一个相对分子质量(Mr)约为60000的蛋白。进一步研究发现,Hsf4b可与MAP激酶P38结合,Hsf4b的C-端转录调控区参与和P38的结合,P38可体外磷酸化Hsf4b。结论:实验首次证明Hsf4b可结合并被P38磷酸化,为进一步探讨Hsf4b在晶状体发育过程中的作用提供新的信号通路。
- 马增翼张军李雪丽席子明胡延忠
- 关键词：晶状体磷酸化
