“十一五”国家科技攻关计划(06G127)
- 作品数：5 被引量：9H指数：2
- 相关作者：金宁一李昌任大勇秦艳青杜寿文更多>>
- 相关机构：军事医学科学院吉林大学吉林农业大学更多>>
- 发文基金：“十一五”国家科技攻关计划国家自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证被引量：1
- 2011年
- 目的:构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,并对其功能进行验证。方法:设计一个包含人巨细胞病毒启动子(CMVpromoter)、T7启动子、信号肽基因、血凝素A表位基因(HA)、多克隆位点区域(MCS)、c-myc抗原表位、血小板来源的生长因子受体跨膜区域(PDGFR TM)及牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpolyA)等八种元素的表达盒Ⅱ(Expressing cassetteⅡ),在其上下游添加NruⅠ酶切位点后,进行人工化学合成,连接到克隆载体pGH中得pGH-Ⅱ;用NruⅠ酶切pGH-Ⅱ,回收1 300bp左右的片段,去磷后插入到pVAX1的相应位点,NruⅠ及BglⅡ/PstⅠ酶切鉴定,获得新型基因疫苗真核表达载体pVAX2;然后以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,将其分别构建至两个不同的表达盒内,脂质体转染BHK-21细胞,利用RT-PCR及荧光显微镜技术进行该载体的功能验证。结果:两个表达盒内的EGFP基因在BHK-21细胞均能高效表达,相互间不受影响,且新构建的表达盒具有蛋白展示功能。结论:成功构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,为多价DNA疫苗的研究奠定了坚实基础。
- 杜寿文李昌王宇航任大勇刘存霞孙丹丹朱娜李沂秦艳青金宁一
- 关键词：EGFP
- 反转录病毒载体介导的EGFP基因在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中的表达被引量：1
- 2011年
- 为了构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的反转录病毒载体,并观察EGFP基因在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中的表达情况。试验将增强型绿色免疫荧光基因片段定向插入反转录病毒载体pFB-neo,获得重组反转录病毒质粒pFB-NE,利用三质粒共转染系统,将含有目的基因的重组反转录病毒质粒pFB-NE以及含有辅助病毒gag-pol和env基因的质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK-293细胞,用产生的重组反转录病毒感染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,并在荧光显微镜下观察EGFP基因的表达。结果表明:重组反转录病毒载体pFB-NE构建正确,重组病毒包装成功,EGFP基因在细胞中能够稳定表达。
- 王婧李昌李林溪胡博丛艳昭任大勇王卓越杜寿文金宁一
- 关键词：反转录病毒载体
- 小提质粒快速排除假阳性克隆的新方法被引量：2
- 2011年
- 对传统的小提质粒方法进行了简化,在15 min内提出重组子质粒,从而快速地排除不含质粒的假阳性菌落。为验证方法的可靠性,构建了7个重组子,并应用PCR方法进一步对筛选结果进行鉴定。结果表明:此方法简便、迅速、可靠、重复性好,适用于革兰氏阴性菌,可以先排除一部分假阳性克隆,缩小筛选范围。
- 任大勇李昌秦艳青杜寿文诸晴丽金宁一
- 关键词：质粒
- 植物乳杆菌melA基因的克隆及其作为食品级筛选标记的初步研究被引量：2
- 2011年
- 以L.plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术成功克隆α-半乳糖苷酶基因(melA基因),与报道的melA基因序列同源性达到99%以上。再以大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e为基本骨架,将melA基因插入该载体,构建melA基因标记的穿梭表达载体pMG36e-melA。重组表达质粒pMG36e-melA经Sac I和Sph I双酶切和PCR鉴定与预期片段大小相符。结果表明已初步构建了以melA基因为食品级筛选标记的重组载体。
- 任大勇李昌秦艳青杜寿文诸晴丽金宁一
- 关键词：Α-半乳糖苷酶穿梭表达载体乳酸乳球菌
- 乳酸乳球菌同源整合载体的构建及鉴定被引量：3
- 2012年
- 构建乳酸乳球菌同源整合载体,实现外源基因在乳酸菌中的同源重组和转入。PCR扩增红霉素抗性基因,连接到T载体中,构建载体pMDE;根据乳酸乳球菌Lactococcus lactis1.2472全基因组中usp基因序列设计引物,PCR扩增usp基因两端的同源重组臂LB和RB基因序列,PCR产物经回收后,克隆至pMDE载体中,获得同源重组载体pMDELR,电转化至Lactococcus lactis1.2472感受态细胞中,挑选阳性克隆,采用PCR和SDS-PAGE方法进行鉴定。结果表明:成功扩增同源重组臂LB和RB,红霉素抗性基因替换了乳球菌中的usp基因,整合到了乳球菌基因组中。
- 秦艳青金宁一李昌任大勇沈明浩
- 关键词：乳酸乳球菌同源重组
