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无胶筛分毛细管电泳检测微量蛋白质方法的建立与评价被引量：9: 2005年; 赵京山温进坤韩梅; 关键词：聚乙烯二醇类

益气活血化瘀方药对血管胶原转换及相关基因表达的影响被引量：19: 2004年; 目的:观察益气活血化瘀中药对大鼠血管细胞外基质(ECM)重塑的影响并探讨其分子机制。方法:采用3H-TdR和3H-Pro掺入实验和血管壁羟脯氨酸含量测定检查血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活性及胶原合成与降解程度;应用Northern印迹和Ⅳ型胶原酶(MMP-2)酶图分析检测MMP-2和骨桥蛋白表达的变化。结果:益气活血化瘀中药可显著抑制bFGF对VSMC的促胶原合成作用,降低血管内皮剥脱大鼠血管壁胶原转换速率,下调MMP-2和骨桥蛋白在体外培养的VSMC及血管壁中的表达水平,抑制VSMC增殖。中药血清去蛋白后对VSMC的影响不发生明显变化。结论:益气活血化瘀中药通过调节MMP-2和骨桥蛋白基因表达及降低胶原转换速率可抑制和(或)减缓ECM重塑。; 韩梅温进坤周秀霞; 关键词：血管基因表达中药

血清应答因子在血管新生内膜形成过程中的表达变化被引量：2: 2005年; 目的探讨SRF与VSMC表型转化及增殖之间的关系。方法建立大鼠颈总胸腹主动脉内皮剥脱后内膜增生模型,应用Northern印迹、Western印迹及免疫组化等方法从RNA和蛋白质水平上检测新生内膜形成过程中SRF表达的动态变化。结果血管内皮剥脱后3d,可见局部内膜增生,中膜平滑肌细胞排列不齐;术后7~14d,内膜呈进行性弥漫增厚,管腔出现狭窄。在增生的内膜中,SRF的mRNA和蛋白水平明显升高,于术后7d达高峰,其动态变化模式与血管内膜增厚速率相一致,但与收缩型VSMC的标志物SM22α的表达却呈反相关变化。结论血管内皮剥脱后SRF表达活性升高与VSMC去分化和新生内膜形成具有直接关系。; 许丽辉韩梅温进坤; 关键词：新生内膜形成表型转化增殖血管平滑肌细胞

SM22α对血管平滑肌细胞骨架及收缩功能的影响被引量：39: 2003年; SM2 2α(smoothmuscle 2 2alpha,SM2 2α)是血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells,VSMC)的标志蛋白 ,为了探讨该蛋白与VSMC表型和功能的关系 ,利用血清饥饿法诱导VSMC由合成型向收缩型转变 ,用RT PCR对不同表型VSMC的SM2 2α表达活性进行检测 ,并通过转染反义SM2 2α表达载体 ,观察SM2 2α表达对VSMC细胞骨架和收缩功能的影响。结果显示 ,在VSMC由合成型逆转为收缩型的过程中 ,SM2 2α和平滑肌α 肌动蛋白 (smoothmuscleα actin,SMα actin)的表达分别被显著诱导和轻度上调 ,与此同时 ,细胞骨架由稀疏的网格状变成均匀、致密的束状 ,VSMC重新获得收缩功能。用反义SM2 2α抑制该基因表达后 ,血清饥饿诱导的VSMC细胞骨架重构受阻 ,乙酰胆碱刺激引发的细胞收缩消失。结果提示 ,SM2 2α参与VSMC细胞骨架的构成及调节细胞的收缩功能。; 程云会韩梅温进坤; 关键词：血管平滑肌细胞平滑肌细胞骨架

重组SM22α C端肽段促进细胞骨架重构被引量：4: 2007年; 目的:探讨SM22αC端功能域肽段与细胞骨架F-actin聚合的关系,明确SM22α在血管平滑肌细胞(VSMC)骨架重构中的作用。方法:构建GST-SM22αC端功能域融合蛋白原核表达质粒pGEX3X-SM22α,诱导E coli高效表达可溶性GST-SM22α融合蛋白,制备抗SM22α抗体,VSMC蛋白分步提取及Western blot检测F-actin/G-actin中SM22α的含量变化,GST-pull down分析和免疫共沉淀检测SM22α与actin的相互作用,细胞免疫双荧光染色观察SM22α和actin在VSMC中的定位关系。结果:所构建的pGEX3X-SM22α原核表达质粒,在0.5mmol/LIPTG,30℃诱导6h条件下,表达可溶性GST-SM22α融合蛋白的水平最高,用纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔获得的抗血清效价为1∶16。免疫双荧光染色和蛋白分步提取分析结果表明,在VSMC再分析过程中,SM22α与F-actin共定位,GSTpull down分析和免疫共沉淀结果均显示,SM22α通过C端功能域与F-actin相互作用而参与细胞骨架的重构;但是,SM22α与G-actin的结合能力较弱。结论:本研究重组得到的SM22αC端功能域具有与F-actin结合的活性,SM22α通过该区域与actin相互作用而参与细胞骨架重构。; 史建红郑斌孟芳温进坤韩梅; 关键词：可溶性表达细胞骨架血管平滑肌

人SM22α在巴斯德毕赤酵母中的表达、纯化及抗体制备被引量：1: 2006年; 目的:用酵母表达重组人平滑肌22α(SM22α)蛋白,制备兔抗人SM22α多克隆抗体。方法:利用PCR从pGEM3z-SM22α质粒扩增得到人SM22α基因编码区,重组至pPIC9构建酵母表达载体,转染巴斯德毕赤酵母,进行分泌型表达。表达产物经分步盐析和CM-纤维素柱层析纯化后,免疫家兔,制备兔抗人SM22α多克隆抗体。结果:所构建的pPIC9-SM22α酵母表达载体转染酵母感受态细胞后,外源性SM22α可整合至酵母染色体中,经甲醇诱导84 h,可实现SM22α的高效表达与分泌。用70%硫酸铵处理上清液,收集沉淀进行离子交换层析纯化后,经变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见一分子量为22 kD的单一区带。用该纯化产物免疫家兔制备的兔抗人SM22α抗血清可用于检测人或大鼠血管壁中SM22α的表达水平。结论:重组人SM22α可在巴斯德毕赤酵母中进行高效表达与分泌,纯化蛋白可用于抗体制备,为研究SM22α功能提供了检测工具。; 温进坤聂磊李静宜程云会韩梅; 关键词：巴斯德毕赤酵母分泌表达抗血清

无胶筛分毛细管电泳法检测微量蛋白质骨桥蛋白被引量：5: 2005年; 采用非涂层毛细管,以150mm o l/L硼酸盐缓冲液为电泳缓冲液,30g/L聚乙二醇(PEG)20000为筛分介质,经对分离条件进行优化,成功地建立了用无胶筛分毛细管电泳检测微量蛋白质的方法。用所建立的方法测定骨桥蛋白,其批内、批间迁移时间的相对标准偏差均小于5%,回收率大于95%,被检测样品中骨桥蛋白的含量与其峰面积呈良好的线性关系(相关系数为0.996),最低检测限为0.079g/L。考察了无血清饥饿培养对血管平滑肌细胞分泌骨桥蛋白的影响,结果表明无血清饥饿培养24h骨桥蛋白的合成与分泌达到高峰,此后随时间延长含量随之降低,此结果与采用W estern b lo t方法检测的结果一致。该方法具有进样量小(nL级)、检测速度快、可自动化等优点,是一种简便、快捷的检测微量蛋白质的好方法。; 赵京山温进坤韩梅; 关键词：毛细管电泳无胶筛分骨桥蛋白血管平滑肌细胞

收缩蛋白在血管新生内膜形成过程中的表达变化及其对血管收缩力的影响被引量：10: 2005年; 目的为了探讨两种收缩蛋白SMα-actin和SM22α在新生内膜形成过程中的表达变化及与血管收缩反应性之间的关系。方法在建立大鼠颈总-胸腹主动脉血管内皮剥脱后内皮增生模型的基础上,用Western blot和免疫组化检测两种收缩蛋白的动态变化,用透射电镜观察VSMC肌丝和用生物法测定血管收缩反应性。结果血管内皮剥脱后,中膜SMα-actin和SM22α的表达下降,以术后7-14d最低,VSMC内肌丝由致密变为稀疏,由束状变为网状,但是血管的收缩反应性显著高于对照组(P<0.05)。结论内皮剥脱后,VSMC的增生及新生内膜的增厚可引起受损血管收缩反应性的升高,这是内皮损伤促发动脉硬化的重要原因。; 程云会韩梅温进坤张永刚; 关键词：血管收缩肌动蛋白类

在线推扫富集-胶束电动毛细管色谱检测旋覆花素中和大鼠血浆中的旋覆花内酯被引量：4: 2006年; 采用熔融石英毛细管,以含有50mm o l/L十二烷基硫酸钠的50mm o l/L硼酸盐缓冲液为电极缓冲液,以10mm o l/L硼酸盐缓冲液为上样缓冲液,经过对分离条件的优化,成功地建立了胶束电动毛细管色谱结合在线sw eep ing(推扫)富集技术检测中性脂溶性物质旋覆花内酯(acety lb ritann ilac tone,ABL)的实验方法。所建方法的批内、批间测定值的相对标准偏差均小于5%,灵敏度为0.005g/L,回收率大于92%;被检测样品的含量与峰面积呈良好的线性关系,相关系数为0.997 5。用所建立的方法检测了旋覆花素中ABL的含量及其在体内的动态变化,结果表明胶束电动毛细管色谱结合在线sw eep ing样品富集技术可显著提高检测的灵敏度。该方法具有操作简单、进样量小(nL级)、检测速度快等特点,弥补了毛细管电泳在测定痕量组分方面的不足。; 赵京山温进坤韩梅; 关键词：胶束电动毛细管色谱旋覆花素大鼠血浆

SM22α:血管平滑肌细胞分化的分子标志被引量：21: 2004年; SM22α是一种分化型血管平滑肌细胞(VSMC)的标志基因,编码一种22 kDa的收缩调节蛋白。由于SM22α基因结构短小,表达具有VSMC特异性、调控机制较为清楚,因而被广泛用于VSMC发育分化的研究。利用该基因的表达调控特征,设计可在VSMC中高表达目的蛋白的人工启动子,是心血管病基因治疗的新策略。; 程云会韩梅温进坤; 关键词：血管平滑肌细胞分化分子标志

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