新疆维吾尔自治区高技术研究发展计划项目(2010016)
- 作品数：8 被引量：13H指数：3
- 相关作者：马正海刘晓娟王雪莹张彩荣赵晓飞更多>>
- 相关机构：新疆大学更多>>
- 发文基金：新疆维吾尔自治区高技术研究发展计划项目国家自然科学基金更多>>
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- 一种1型单纯疱疹病毒载体系统的建立被引量：4
- 2015年
- 1型单纯疱疹病毒(HSV-1)作为溶瘤病毒和病毒载体的研究已有很长的历史.本研究利用细菌人工染色体技术建立了一种HSV-1载体系统.首先,将HSV-1内部反向重复序列(internal inverted repeat sequences,IR)两侧的片段克隆入p KO5获得穿梭质粒p KO5/BN,其电转含p HSVBAC的大肠杆菌后筛选获得删除IR区重组DNA的p HSVΔIR-BAC.p HSVΔIR-BAC转染Vero细胞获得删除IR区的重组病毒HSVΔIR(MH1001).上述p KO5/BN和含p HSVΔIR-BAC的大肠杆菌构成了HSV-1载体系统.利用该系统获得了表达绿色荧光蛋白EGFP的重组病毒HSVΔIR/EGFP(MH1002).MH1001和MH1002在感染的Vero细胞中增殖水平略低于野生型HSV-1,但无显著差异;Western印迹检测表明,重组病毒早期蛋白质ICP0、ICP4、ICP8、ICP22、ICP27在感染细胞中的表达水平下降;免疫荧光及激光共聚焦检测表明,重组病毒与野生型病毒均存在于细胞质中.以上结果表明,删除IR区的重组HSV-1保留了复制能力,能够携载并表达外源基因,建立的HSV-1载体系统可用于构建携载外源基因的复制型重组HSV-1.
- 王雪莹赵晓飞李永鑫朱慧马正海
- 关键词：1型单纯疱疹病毒病毒载体细菌人工染色体
- 携带HIV-1抗原的单纯疱疹病毒载体疫苗的构建及鉴定
- 2015年
- 利用细菌人工染色体技术将串联的HIV-1 gp160、gag和protease基因以及表达元件插入1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)内部反向重复序列区,以获得携带HIV-1抗原的单纯疱疹病毒载体疫苗。首先将HIV-1 gp160(B型和C型)、gag和protease基因串联克隆入pc DNA3获得重组质粒pc DNA/g Bgp和pc DNA/g Cgp,重组质粒转染293FT细胞,Western blotting检测HIV抗原表达。继而将pc DNA/g Bgp和pc DNA/g Cgp中包括HIV-1抗原基因和表达元件的表达框克隆入p KO5/BN获得重组穿梭质粒p KO5/BN/g Bgp和p KO5/BN/g Cgp,穿梭质粒电转含BAC-HSV的大肠杆菌,筛选重组菌,提取重组DNA并转染Vero细胞,挑取病毒蚀斑纯化重组病毒,Southern blotting鉴定重组病毒DNA,Western blotting检测重组病毒感染细胞中HIV抗原表达,并分析病毒的增殖特性。结果表明,Western blotting在pc DNA/g Bgp和pc DNA/g Cgp转染的293FT细胞中检测到表达的gp160和gag蛋白。p KO5/BN/g Bgp和p KO5/BN/g Cgp分别电转获得重组菌,并从重组DNA转染的Vero细胞中纯化获得重组HSV,Southern blotting检测表明重组HSV基因组发生特异性重组,重组病毒感染细胞中检测到gp120和gp41,且重组HSV保留了在哺乳动物细胞中的复制能力。本研究获得携载HIV-1 gp160、gag和protease基因的重组HSV,并保留了在哺乳动物细胞中的复制能力,可作为HIV-1复制型病毒载体疫苗。
- 赵晓飞郭景霞刘晓娟马正海
- 关键词：1型单纯疱疹病毒细菌人工染色体
- 重组溶瘤单纯疱疹病毒抑制小鼠结肠癌肺转移瘤的实验研究被引量：1
- 2020年
- 探讨携载p53和IL-12的重组溶瘤单纯疱疹病毒(Oncolytic Herpes Simplex Virus-1,oHSV)MH1004和MH1006对小鼠结肠癌皮下移植瘤和肺转移瘤的治疗作用.蚀斑法和MTT法分析重组oHSV对结肠癌细胞CT26的感染和溶瘤特性;小鼠背部皮下注射CT26建立皮下移植瘤模型,瘤内注射重组oHSV后分析小鼠血清中IL-12含量,观察肿瘤大小和小鼠生存率;小鼠尾静脉注射CT26建立肺转移模型,尾静脉注射重组oHSV后显微观察肺组织中肿瘤细胞浸润,观察肺脏肿瘤结节和小鼠生存率.重组oHSV能够感染CT26并高效复制和抑制肿瘤细胞.皮下移植瘤小鼠治疗12 d后观察到抑瘤效应,MH1004和MH1006组21 d时肿瘤体积(2477.31±2017.02 mm3和1414.36±1639.19 mm3)均极显著小于Mock组(7682.92±2648.74 mm3)(P<0.01),42 d时生存率(均为100%)明显高于HSV-wt和Mock组(均为50%);MH1006组小鼠血清中IL-12含量增加,第16 d时极显著高于Mock组(P<0.01);治疗后肿瘤消失小鼠血清中IL-12含量明显增高.肺转移瘤小鼠治疗后,MH1004和MH1006组小鼠肺脏肿瘤结节数在治疗5 d、9 d和13 d时均极显著低于Mock组(P<0.01),13 d极显著低于HSV-wt组(P<0.01),且o HSV治疗小鼠肺组织浸润的肿瘤细胞明显减少;60 d时MH1004组、MH1006组、HSV-wt组和Mock组的生存率依次为83.3%、66.7%、66.7%和50%,MH1004组和MH1006组死亡小鼠肺脏肿瘤结节少于Mock组和HSV-wt组.携载IL-12和p53的重组o HSV经尾静脉注射治疗小鼠结肠癌肺转移瘤效果显著,该研究为转移瘤治疗提供了新的思路.
- 张政彭瑞娟阿木提喀日·马木提刘晓娟王雪莹马正海
- 关键词：IL-12P53结肠癌肺转移瘤
- 单纯疱疹病毒1型囊膜糖蛋白gD在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性的鉴定
- 2014年
- 目的:在大肠杆菌中表达1型单纯疱疹病毒(HSV-1)囊膜糖蛋白gD,纯化重组蛋白并对其免疫活性进行鉴定。方法:将HSV-1 gD基因克隆入原核表达载体p ET-28b,利用异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒转化的大肠杆菌,探讨IPTG浓度、诱导时间、诱导温度对重组蛋白表达的影响;盐酸胍裂解变性包涵体,镍柱亲和层析法纯化gD蛋白,并对纯化后的蛋白进行透析复性;Western blot和ELISA检测gD蛋白的免疫活性。结果:酶切和测序结果表明gD基因克隆入p ET-28b载体。该重组质粒转化的大肠杆菌经IPTG诱导后重组蛋白主要以包涵体形式存在,大小约40k Da。gD蛋白诱导表达的最佳条件为0.5mmol/L IPTG于37℃诱导8h。镍柱亲和层析法纯化获得的gD蛋白总量为3.1mg/L,透析复性后获得的gD蛋白总量为1.3mg/L,复性率为41.37%。Western blot及ELISA检测表明表达的gD蛋白具有免疫活性。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得具有免疫活性的HSV-1 gD蛋白,为进一步制备HSV-1诊断试剂和预防疫苗奠定了基础。
- 毛红艳马正海
- 关键词：1型单纯疱疹病毒GD大肠杆菌免疫活性
- 表达HIV-1 gag蛋白的重组乳酸乳球菌诱导小鼠产生体液免疫应答被引量：3
- 2014年
- 目的分析表达HIV-1 gag蛋白的重组乳酸乳球菌通过口服、滴鼻、皮下注射以及上述3种方式联合免疫小鼠诱导的体液免疫反应。方法将50只BALB/c小鼠随机分成5组,每组10只。表达gag的重组乳酸乳球菌分别通过口服、滴鼻、皮下注射以及上述3种方式联合免疫小鼠,对照组口服含PMG36e空载体的乳酸乳球菌,接种菌量均为109菌落形成单位(CFU),连续免疫3次,每次间隔2周,其中口服和滴鼻每次连续免疫3 d。采集免疫前和每次免疫后2周小鼠的血清,ELISA检测gag特异性的IgG水平。结果表达gag的重组乳酸乳球菌经口服、滴鼻、皮下注射以及3种方式联合免疫均诱导小鼠产生了gag特异性IgG,且联合免疫组gag IgG水平显著高于其他各实验组(P<0.01)。初次免疫后6周,口服和皮下注射免疫组gag IgG水平显著高于滴鼻免疫组(P<0.01)。免疫3次后各组血清中gag抗体的阳性率:口服免疫组分别为40%、40%、90%;滴鼻免疫组分别为10%、20%、20%;皮下免疫组分别为10%、60%、90%;联合免疫组的阳性率在初次免疫后2周已达到100%。结论表达HIV-1 gag的重组乳酸乳球菌载体疫苗经口服、滴鼻、皮下注射及3种方式联合免疫均能诱导小鼠产生特异性的体液免疫反应,多种途径联合免疫可增强乳酸乳球菌载体疫苗的免疫效果。
- 赵晓飞张彩荣刘晓娟马正海
- 关键词：乳酸乳球菌HIV-1GAG免疫途径
- 表达HIV-1gag蛋白重组乳酸乳球菌株的建立及其在小鼠体内定植的研究被引量：3
- 2013年
- 目的构建表达HIV-1gag的重组乳酸乳球菌，并分析重组菌在小鼠体内的定植情况。方法将HIV-1gag克隆至原核表达质粒pMG36e，重组质粒pMG36e-gag电转乳酸乳球菌，SDS-PAGE和Western blot法检测其在乳酸乳球菌中的表达。以10^9个重组菌给小鼠口服，对照组口服PBS。口服后第1、3、5、7、9、11天分别取小鼠的胃、小肠和大肠，采用稀释滴种法测定小鼠胃、肠道内重组菌的数量。结果酶切和DNA测序表明gag已克隆人pMG36e。SDS—PAGE在预期位置检测到蛋白条带，Western blot分析证实其为gag蛋白。重组菌定植实验表明，第1、3天在胃肠均有一定量重组菌，且大肠中重组菌数量多于胃和小肠，随后胃肠中重组菌均迅速减少，仅在大肠中仍有一定量的重组菌，第11天时胃肠仅分离到极少量的重组菌。结论本研究获得胞内表达HIV-1gag前体蛋白Pr55的重组乳酸乳球菌，其可在胃肠中短期存活，可作为预防HIV-1感染的候选疫苗。
- 张彩荣吴玲玲侯向前马正海
- 关键词：乳酸乳球菌HIV-1GAG定植黏膜免疫
- 携带p53基因的重组1型单纯疱疹病毒溶瘤特性的实验观察被引量：3
- 2016年
- 目的利用同源重组技术获得插入p53基因的重组1型单纯疱疹病毒（HSV-1），并在体外培养细胞和荷瘤小鼠中研究其溶瘤特性。方法将含p53基因的真核表达框克隆人含HSV-1同源重组臂的pK05／BN，获得重组穿梭质粒pK05／p53，其电转含pHSV△IR—BAC的大肠杆菌后，筛选获得含有p53的重组DNApHSVAIR—BAC／053。pHSV△IR-BAC／053转染Vero细胞获得重组病毒，经Southem印迹和Western印迹鉴定正确后命名为MH1004。分别检测MH1004感染多种肿瘤细胞24h后的滴度，分析其在肿瘤细胞中的复制特性。建立小鼠黑色素瘤模型，于0、3、6d瘤内分别注射2×106 PFU的MH1004、未插入p53基因的重组HSV-1（MH1001）、HSV-1wt和PBS，观察肿瘤大小和小鼠生存时间并作统计学分析。结果Western印迹检测表明MHl01M所携带的p53基因可在感染细胞中表达；在同种肿瘤细胞中，MHIOIM和HSV-1wt的复制水平差异无统计学意义（P〉O．05）；MH1004在SK—N．SH和U251细胞中的复制水平显著高于其在其他肿瘤细胞中的复制水平；治疗15d后，HSV-1 wt、MH1001和MHl004组小鼠的肿瘤体积分别为（6180±751）、（5760±267）和（4850±532）mm3，显著小于PBS对照组（9860±91）mm3（均P〈0．01），MHl004组肿瘤体积小于MH1001组和HSV．1wt组，但差异均无统计学意义（均P〉0．05）。MH1004组小鼠生存率（5／6）显著高于PBS组（3／6）、HSV-1wt组（3／6）和MHl001组（3／6）。结论MH1004在神经肿瘤细胞中的复制水平较高，能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，并延长荷瘤小鼠的生存期。
- 王雪莹朱慧汪习刘晓娟马正海
- 关键词：溶瘤病毒
- 携载人IL－12的重组1型单纯疱疹病毒溶瘤特性的观察被引量：5
- 2017年
- 目的构建删除ICP47并携载人IL－12的重组HSV－1，并在体外培养细胞和荷瘤小鼠体内研究其溶瘤特性。方法利用细菌人工染色体技术获得删除ICP47的重组HSV－1 MH1005及其携载人IL－12的重组HSV－1 MH1006。检测HSV－wt、MH1005和MH1006感染多种神经肿瘤细胞时的复制水平和抑瘤效果。在小鼠背部两侧皮下注射Neuro－2a细胞建立荷瘤小鼠模型，分别于0、3和6 d在一侧瘤内注射2×106 PFU HSV－wt、MH1001（删除IR的重组HSV－1）、MH1005、MH1006和病毒储液（Mock），观察肿瘤大小和小鼠生存时间。结果MH1005、MH1006和HSV－wt在293FT细胞中的复制能力差异均无统计学意义（均P〉0.05）；重组HSV－1在G422和Neuro－2a细胞中的复制能力高于SK－N－SH细胞；重组HSV－1可显著抑杀神经肿瘤细胞。荷瘤小鼠治疗15 d时，HSV－wt、MH1001、MH1005和MH1006治疗组病毒注射侧肿瘤体积依次为（6 267±484）、（5 730±1 071）、（4 537±538）和（4 150±476） mm3，显著〈Mock组肿瘤体积（6 957±722） mm3（P〈0.01）；未注射侧肿瘤中，MH1005[（5 952±607） mm3]和MH1006[（5 473±661） mm3]治疗组肿瘤体积显著〈HSV－wt组[（6 785±1 063） mm3]、MH1001[（6 774±808） mm3]和Mock组[（6 957±190） mm3]（均P〈0.05）；小鼠治疗35 d时MH1005（100%）和MH1006组（100%）生存率显著高于MH1001组（67%）、HSV－wt治疗组（50%）和Mock组（33%）（均P〈0.05）。结论MH1005和MH1006可感染神经肿瘤细胞并高效复制，其直接抑杀肿瘤细胞的同时还可诱导小鼠对肿瘤细胞的免疫排斥，并延长荷瘤小鼠生存期。
- 刘晓娟王雪莹郭景霞朱红娟张彩荣马正海
- 关键词：白细胞介素12神经胶质瘤
