国家自然科学基金(30871135)
- 作品数：2 被引量：13H指数：1
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- 靶向髓样细胞表达的激发受体1基因短发夹RNA真核质粒表达载体的构建及筛选
- 2011年
- 目的 构建编码髓样细胞表达的激发受体1（TREM-1）基因短发夹RNA（shRNA）真核质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 针对TREM-1的靶位点设计含shRNA的靶序列,分别构建pGCsi-TREM-1 shRNA1和pGCsi-TREM-1 shRNA2的质粒表达载体和pGCsi-NegshRNA阴性质粒表达载体,通过酶切及测序进行鉴定.鉴定后以脂质体包裹转染肺泡上皮A549细胞,分为未转染对照组（A组）、转染空质粒载体pGCsi对照组（B组）、转染阴性shRNA质粒表达载体pGCsi-NegshRNA对照组（C组）、转染TREM-1 shRNA1质粒表达载体组（D组）和转染TREM-1shRNA2质粒表达载体组（E组）,48 h后观察转染细胞绿色荧光蛋白表达效果.转染24、48、72 h后,以A组为对照采用MTT法测定B、C、D、E组细胞的存活率.转染48 h后,通过荧光定量PCR检测各组TREM-1 mRNA的表达水平并与转染前相比较.结果 经酶切和测序鉴定证实,目的 TREM-1基因shRNA1和shRNA2片段已被克隆到pGCsi载体中.荧光显微镜下,B、C、D、E组A549细胞有明显的绿色荧光蛋白表达.各时间点B、C、D、E组细胞存活率均达90%以上.A、B、C 3组转染前后TREM-1mRNA的表达水平差异无统计学意义,D、E组转染的重组质粒均能有效抑制A549细胞的TREM-1mRNA的表达（[（1.945±0.252）×105比（1.010±0.194）×105,（1.933±0.216）×105比（1.202±0.171）×105,均P＜0.05],抑制率分别为48.07%和37.82%.结论 成功构建了靶向TREM-1基因的shRNA质粒表达载体,可有效抑制细胞中TREM-1目的 基因的表达,为后续脓毒症的基因治疗提供了依据.
- 莫红缨黎毅敏肖正伦黄红川杨淳何为群刘晓清
- 关键词：短发夹RNA质粒RNA干扰基因表达
- 细菌细胞壁人髓系细胞触发受体-1天然配体的研究被引量：13
- 2010年
- 目的 寻找人髓系细胞触发受体-1（TREM-1）的天然配体,为阐明脓毒症的发病机制提供理论依据.方法 分离人外周血中性粒细胞和单核细胞进行原代培养.在两种分离培养的细胞中分别加入热失活的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌或高渗诱导金黄色葡萄球菌L型、铜绿假单胞菌L型处理24 h.在两种分离培养的细胞中分别加入超声提取的金黄色葡萄球菌细胞壁、铜绿假单胞菌细胞壁或结核分枝杆菌细胞壁处理24 h.在两种分离培养的细胞中分别加入各细胞壁三大组分（细胞壁多糖、细胞壁脂类、细胞壁蛋白）处理24 h.用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测各处理组细胞TREM-1 mRNA水平,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各处理组细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）浓度.结果 金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的菌体、细胞壁和细胞壁多糖处理后中性粒细胞和单核细胞TREM-1mRNA水平以及细胞培养上清液中TNF-α和IL-1β浓度均明显升高.与空白对照组相比,金黄色葡萄球菌细胞壁多糖处理后中性粒细胞TREM-1 mRNA水平增加了（3.86±0.20）倍,单核细胞TREM-1 mRNA水平增加了（5.15±0.56）倍（均P＜0.05）;铜绿假单胞菌细胞壁多糖处理后中性粒细胞TREM-1 mRNA水平增加了（4.03±0.15）倍,单核细胞TREM-1 mRNA水平增加了（7.22±0.73）倍（均P＜0.05）.加入能竞争性结合TREM-1配体的LP17可以削弱此效应;而结核分枝杆菌的菌体、细胞壁和细胞壁组分均无此效应.结论 人TREM-1天然配体位于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的细胞壁上,成分可能为细菌细胞壁多糖.
- 余志辉黄红川毛璞刘冬冬莫红缨何为群刘晓青黎毅敏
- 关键词：脓毒症髓系细胞触发受体-1配体多糖
