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不同剂量中波紫外线对HaCaT细胞p62及自噬体形成关键基因Beclin-1、Atg12和Atg3的调控效应研究被引量：2: 2014年; 目的探讨不同剂量中波紫外线（UVB）照射培养的HaCaT细胞后不同时间点对p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白表达水平的调控效应。方法使用4．5、10和50mJ／cm2 UVB照射HaCaT细胞，照射后加入新鲜培养基继续培养4h和12h，同时设相同处理但不照射UVB的细胞为对照细胞。另设观察组，在照射后立即（包括对照细胞），使用含蛋白酶抑制剂E64D（10ug／L）和胃酶抑素（10ug／L）的培养基孵育4h和12h，以阻断对p62的降解。使用Western印迹法测定Hac胛细胞p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白的表达水平。结果50mJ／cm2 UVB照射HaCaT细胞后4h，p62表达水平（p62与内参的比值为0．473±0．022）较对照细胞（0．246±0．038）升高（t=15．27，P〈0．05）；阻断溶酶体后，细胞新生p62的水平（0．445±0．035）与阻断溶酶体的对照（0．244±0．016）相比，仍为上调（t=7．62，P〈0．05）。在4．5mJ／cm2 UVB照射细胞后12h，与对照（0．254±0．035）相比，HacaT细胞p62表达上调（0．497±0．047，t=22．89，P〈0．05）；阻断溶酶体后，与阻断溶酶体的对照（0．257±0．025）相比，p62表达水平仍然上调（0．548±0．051，t=17．42，P〈0．05）。4．5mJ／cm2和50mJ／cm2 UVB照射后4h和12h，对照细胞和照射细胞间的Beelin-1、Atg12和Atg3的表达差异均无统计学意义（P〉0．05），阻止溶酶体对白噬体内容物的降解也未能发现Beclin-1、Atg12和Atg3的表达差异（P〉0．05）。结论p62表达在不同剂量UVB照射和照射后不同时间存在差异调控，并且这种调控效应与自噬体形成可能没有生物学联系。; 金慧陈旭徐松曹蕾黄丹鞠梅陈崑李新宇周之海顾恒; 关键词：角蛋白细胞原癌基因蛋白质类 BECLIN-1

中波紫外线对角质形成细胞NF-κB p65及其抑制因子IκBα表达的影响被引量：1: 2014年; 目的探讨不同剂量中波紫外线（UVB）照射对体外培养的人皮肤角质形成细胞NF-κB p65及其抑制因子IκBα表达的调控效应.方法 4.5、10及50 mJ/cm2UVB照射人角质形成细胞系及人原代角质形成细胞,设置未经照射的对照组,在照射后4h使用Western印迹法测定细胞总蛋白中IκBα及NF-κB p65的表达水平.并对人原代角质形成细胞进行50 mJ/cm2UVB照射,照射后继续培养2、4、8、12h,分别测定4个时间点IκBα及NF-κB p65的表达水平.蛋白条带密度分析使用Quantity One（R）4.6.8软件,分别计算IKKβ、IκBα、NF-κB p65以及磷酸化IKKα/β、IκBα、NF-κB p65和β肌动蛋白条带吸光度和面积的乘积,再分别计算IKKβ、IκBα和NF-κB p65与β肌动蛋白的比值,取3次实验结果.结果 4.5和10 mJ/cm2 UVB照射后4h,相对于对照组细胞,人角质形成细胞系及人原代角质形成细胞总蛋白中IKKβ、IκBα、NF-κB p65表达水平均无明显变化（P＞ 0.05）;50 mJ/cm2 UVB照射后4h,细胞系及原代角质形成细胞中IKKβ表达水平均无明显变化（P＞0.05）;原代角质形成细胞IκBα表达水平（0.173±0.055）较对照组细胞（0.462±0.142）显著降低（t=5.64,P＜ 0.05）,NF-κB p65表达水平（0.076±0.030）也较对照组细胞（0.120±0.034）降低（t=5.40,P＜0.05）;角质形成细胞IκBα表达水平（0.160±0.046）较对照组细胞（0.398±0.136）轻度下调（t=4.37,P＜0.05）,NF-κB p65的表达水平无明显变化（P＞0.05）.50 mJ/cm2 UVB照射原代角质形成细胞后2h,IκBα表达水平（0.140±0.034）相对于对照组细胞（0.208±0.031）开始下调（t=17.55,P＜ 0.05）,并随照射后时间延长下调效应更为显著;NF-κB p65的表达水平在2h和4h时较对照细胞无明显变化（P＞0.05）,8h时（1.162±0.345）较对照细胞（1.235±0.349）表达水平下调（t=36.67,P＜0.05）,12 h时（1.061±0.246）较对照细胞（1.390±0.226）仍下调（t=8.71,P＜0.05）,随着时间的推; 丁兰陈旭徐松黄丹鞠梅陈崑李新宇顾恒施辛; 关键词：角蛋白细胞

皮肤光老化小鼠模型的构建被引量：19: 2014年; 目的:构建昆明鼠皮肤光老化小鼠模型。方法:采用模拟日光组分的紫外线照射昆明小鼠,初始照射剂量为最小红斑量,剂量周递增。然后进行照射组和对照组小鼠皮肤大体形态参数和组织学特征比较,进而从分子水平比较丙二醛产物水平和p53表达水平。结果:照射小鼠皮肤厚度为0.0507±0.0082 cm较对照小鼠皮肤0.0397±0.0063 cm厚(P<0.05);照射组皮肤皱纹评分较对照组增高(P<0.05);组织学特征分析发现照射组小鼠皮肤出现显著的胶原纤维和弹力纤维光老化组织学特征。照射组小鼠皮肤丙二醛水平和p53表达显著升高。结论:皮肤光老化小鼠模型的建立为皮肤光老化的研究提供了可用的模型。; 陈旭王莹鞠梅陈崑顾恒; 关键词：光老化紫外线小鼠

α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬的影响被引量：1: 2015年; 目的：评价α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法人皮肤成纤维细胞与终浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L 的α硫辛酸孵育4、12和24 h 后，采用噻唑蓝法检测细胞增殖活性，单丹酰戊二胺（MDC）染色法检测细胞自噬水平，Western 印迹法检测微管相关蛋白1轻链3-B（LC3-B）表达。结果孵育4 h 和12 h 时，0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间人皮肤成纤维细胞增殖活性（A490值）差异均无统计学意义（F 值分别为2.85、1.34，均 P 〉0.05）；孵育24 h 时，各组间差异有统计学意义（F =10.41，P 〈0.01）。MDC 法检测显示，孵育4 h 和12 h 时，0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间自噬体阳性细胞百分率差异均无统计学意义（F 值分别为0.11、0.10，均 P 〉0.05）；孵育24 h 时，各组间差异有统计学意义（F =8.03，P 〈0.05）。Western 印迹法检测显示，孵育4 h 和12 h 时，0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间细胞 LC3-Ⅰ向 LC3-Ⅱ转化（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）水平差异均无统计学意义（F 值分别为3.38、2.13，均 P 〉0.05），但孵育24 h 时各组间差异有统计学意义（F =37.49，P 〈0.01）。结论α硫辛酸可能抑制人皮肤成纤维细胞基础自噬。; 郑云鹏陈旭黄丹徐松顾恒; 关键词：自噬成纤维细胞

角质形成细胞中的自噬现象被引量：3: 2012年; 自噬是细胞内溶酶体降解胞内大分子或细胞器的过程。最近研究提示，角质形成细胞中存在自噬现象。自噬参与角质形成细胞的分化过程，也是老化的角质形成细胞的死亡方式。部分上皮源性肿瘤中自噬被诱导，可能与其侵袭性、转移有关。自噬减轻角质形成细胞中的炎症。某些药物如卡泊三醇、氨基酮戊酸、5-氟尿嘧啶可诱导自噬而发挥相关作用，自噬还可能参与角质形成细胞、黑素细胞中巨大黑素颗粒或巨大黑素小体的形成。概述自噬在角质形成细胞中的作用。; 任发亮黄丹陈旭顾恒; 关键词：角质形成细胞自噬细胞分化

慢性紫外线损伤小鼠模型皮肤角质形成细胞中CK5和CK14表达研究被引量：4: 2013年; 目的:观察慢性紫外线(utraviolet,UV)损伤对小鼠角质形成细胞CK5和CK14表达的调控效应。方法:采用模拟日光UV(UVA+UVB)光源对实验小鼠进行照射,照射从最小红斑量(MED,UVB0.07.J/cm^2,UVA0.7 J/cm^2),每周增加0.5个MED,每日1次,每周照射5 d,共9周,UVB总剂量达9.45 J/cm^2,UVA总剂量达94.5.J/cm^2,通过组织学观察、特殊化学染色和表皮厚度测量确定皮肤损伤,应用免疫组化法分别对照射前后(W0和W9)CK5和CK14的表达进行检测。应用Wilcoxon符号秩和检验和Spear-man秩相关系数进行统计分析。结果:对照组小鼠实验前、后CK5和CK14表达差异均无统计学意义(P>0.05)。损伤组小鼠实验前CK5和CK14的表达差异均有统计学意义(P<0.05),并且损伤组小鼠的CK5和CK14表达呈现明显的定位改变,在增厚的表皮中呈现弥漫的表达,失去在正常表皮中表达于基底细胞层的定位特点。损伤组小鼠表皮角质形成细胞内的CK5和CK14表达均显著上调,且二者的表达呈现正相关性(r=0.840,P<0.05)。结论:重复UV暴露导致小鼠角质形成细胞中CK5和CK14表达上调和定位异常。以上述两种角蛋白为标志物的基底层细胞过度增殖可能参与了慢性UV皮肤损伤出现表皮增厚的发生。; 郭新云陈旭王莹姜鹏爽夏立君蒋靖陈崑顾恒周之海; 关键词：紫外线角质形成细胞 CK5 小鼠

雷帕霉素对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬诱导效应及其分子机制的初步研究被引量：2: 2014年; 目的:初步探讨雷帕霉素在不同浓度和不同孵育时间下,对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的诱导效应及其分子机制。方法:不同浓度雷帕霉素处理HaCaT细胞4 h或12 h后,利用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测雷帕霉素对细胞活力的影响,并提取蛋白进行蛋白印迹实验,检测LC3-Ⅱ表达水平,作为自噬的检测方法;通过透射电镜分析自噬体形成,确认雷帕霉素对自噬的诱导效果。检测自噬调控上游关键元件哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表达及其se^(2481)和ser^(2448)磷酸化产物水平,分析mTOR活性;并分析自噬调控下游的另一关键基因Atg7的表达,初步分析雷帕霉素诱导HaCaT细胞的分子机制。结果:不同浓度雷帕霉素处理4 h,对HaCaT细胞的活力没有显著的影响。高剂量雷帕霉素(80 nmol/L和100 nmol/L)在处理12 h后对HaCaT细胞的活力产生毒性效应。20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h诱导HaCaT细胞LC3-Ⅱ表达上调,而20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育12 h仍具有诱导效应。相较于其他浓度,在50 nmol/L雷帕霉素孵育诱导的LC3-Ⅱ表达上调效应最为显著,并且在药物孵育4h时超微结构水平诱导产生胞质内大量自噬体形成。1~50nmol/L浓度的雷帕霉素孵育4 h或12 h均可诱导HaCaT细胞mTOR ser^(2481)和mTOR ser^(2448)磷酸化产物水平降低:然而Atg7表达不能观测到显著的差异。结论:50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h具有显著的诱导HaCaT细胞自噬效应。HaCaT细胞mTOR分子对雷帕霉素处理敏感,可被其诱导产生蛋白活化抑制效应。这种mTOR信号抑制可能参与了雷帕霉素对HaCaT细胞的自噬诱导效应,但Atg7没有参与这种调控效应。; 陈旭徐松黄丹鞠梅陈崑李新宇顾恒; 关键词：雷帕霉素角质形成细胞自噬

西罗莫司对UVB照射HaCaT细胞自噬的影响: 2013年; 目的探讨西罗莫司能否增加中波紫外线（UVB）照射下HaCaT细胞的自噬水平。方法0、25、50mJ／cm^2 UVB照射HaCaT细胞，单丹（磺）酰戊二胺（MDC）染色法检测自噬。设置空白组、DMSO组、25mj／cm^2 UVB组、25mJ／cm^2 UVB＋西罗莫司组、50mJ／cm2UVB组、50mJ／cm^2 UVB＋西罗莫司组共6组，MDC染色法检测自噬，并比较各组自噬水平。结果结果UVB照射HacaT细胞后出现了自噬，0、25、50mJ／cm^2照射组自噬体阳性细胞分别为1．07％±1．85％、9．37％±1．14％、16．29％±3．03％，3个剂量间差异有统计学意义；6组自噬体阳性细胞百分率分别为：0．56％±0．79％、1．61％±2．27％、10．00％±0．47％、21．18％±3．03％、15．82％±4．13％、29．45％±1．24％，各组两两比较差异均有统计学意义，且25mJ／cm^2 UVB＋西罗莫司组、50mJ／cm^2 UVB＋西罗莫司组的自噬水平均高于相应UVB组。结论UVB辐照HaCaT细胞后出现MDC染色自噬体阳性细胞，西罗莫司可能增加UVB照射下HaCaT细胞后的自噬水平。; 任发亮黄丹陈旭郑云鹏陈崑鞠梅常宝珠李新宇顾恒; 关键词：角蛋白细胞自噬西罗莫司

长波紫外线对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响被引量：2: 2015年; 目的探讨长波紫外线（UVA）对人皮肤成纤维细胞（HSF）自噬水平的影响。方法 HSF慢性UVA照射分组：未照射组、5 J/cm^2组、10 J/cm^2组和20 J/cm^2组，每天照射1次连续4 d；HSF急性照射分组：未照射组、5 J/cm^2组、10 J/cm^2组、30 J/cm^2组和60 J/cm^2组，单次照射。采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐分析法（MTT）检测细胞增殖活力。单丹酰戊二胺染色法（MDC）检测细胞自噬体。Western印迹法检测细胞LC3蛋白LC3-I向LC3-II转化分析（LC3-II/LC3-I）。结果与未照射组HSF比较，5、10、20 J/cm^2慢性UVA照射组细胞增殖活力降低（F = 155.5，P 〈 0.05）。与未照射组HSF比较，5、10、30、60 J/cm^2急性UVA照射后1、6和12 h，细胞增殖活力均降低（F值分别为1 335、1 649、2 774、均P 〈 0.05）。MDC法标记细胞自噬囊泡，与未照射组比较，5、10、20 J/cm^2慢性照射均可上调细胞自噬水平（F = 748.62，P 〈 0.05），而5、10、30、60 J/cm^2急性照射后1、6和12 h对细胞自噬水平无明显影响（F值分别为0.014、0.004、0.002，均P ＞ 0.05）。5、10和20 J/cm^2慢性照射组LC3-I向LC3-II转化（LC3-II/LC3-I）均增加（t 值分别为9.002、21.772、18.33，均P 〈 0.05），细胞自噬水平上调。与未照射组比较，5、10、30、60 J/cm^2急性照射后1、6和12 h，细胞LC3-I向LC3-II转化均无明显变化（F值分别为0.13、0.27、0.06，均P ＞ 0.05），对细胞自噬水平无明显影响。结论慢性UVA照射可上调HSF自噬水平，急性UVA照射HSF自噬无明显变化。; 郑云鹏陈旭黄丹徐松顾恒; 关键词：紫外线自噬成纤维细胞细胞增殖

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国家教育部博士点基金(20111106110041)

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