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国家科技支撑计划(2013BAK11B01): 作品数：23 被引量：84H指数：7; 相关作者：贺争鸣岳秉飞李晓波付瑞王淑菁更多>>; 相关机构：中国食品药品检定研究院广东省实验动物监测所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所更多>>; 发文基金：国家科技支撑计划广东省科技计划工业攻关项目国家自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>

多杀性巴氏杆菌prfA基因的序列分析与原核表达被引量：1: 2014年; 为探索多杀性巴氏杆菌的致病机理，采用PCR方法分别扩增了家兔源和禽源多杀性巴氏杆菌C51—17、Pm898、Pm8916、Pm901、Pr09616、PmZM、PmQin菌株的prfA基因，并对其进行序列分析。将C51—17株的prfA基因克隆到质粒pET30a中，将重组表达载体pET30a—prfA转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，经IPTG诱导表达，进行SDS—PAGE分析和Western—blot分析。结果显示，这7株菌株与GenBank登录的3株多杀性巴氏杆菌之间prfA基因在核苷酸水平上的同源性为95．6％～100％，在氨基酸水平上的同源性为98．9％～100％。诱导表达的重组蛋白PrfA的分子质量约为45．6ku，与预期的大小一致，以可溶性形式表达。重组蛋白PrfA可与家兔抗多杀性巴氏杆菌阳性血清反应，具有良好的反应原性。; 李影郭东春王淑亚张爱芹胡晓亮王雅静刘家森姜骞曲娟娟曲连东; 关键词：多杀性巴氏杆菌原核表达

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及初步应用被引量：6: 2014年; 目的建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,应用于临床样品中FHV-1的快速检测。方法根据已发表的FHV-1TK基因序列设计合成引物,并以此建立FHV-1的PCR检测方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证。用建立的方法对15份猫临床样品进行检测。结果建立的FHV-1PCR检测方法与单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、犬疱疹病毒(CHV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猫细小病毒(FPV)均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为7lg TCID50/ml,相应的DNA模板浓度为1.46×102拷贝/ml;FHV-1DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带。应用该方法从15份猫临床样本中检测出10份FHV-1核酸阳性。结论建立的FHV-1PCR检测方法具有特异、敏感及稳定的特点,适合于临床FHV-1的感染检测。; 王吉付瑞卫礼李晓波王淑菁巩薇岳秉飞贺争鸣; 关键词：聚合酶链式反应

白色念珠菌TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测及抗真菌药物敏感性分析被引量：2: 2017年; 目的:建立TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应方法,快速定量检定临床标本中的白色念珠菌并进行抗真菌药物敏感性分析。方法:针对白色念珠菌内转录间隔区和26S核糖体核糖核酸基因设计特异性引物和探针,构建含有上述基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法,评价其特异性、灵敏度、重复性和稳定性。对1 185份临床标本中的白色念珠菌进行检测,同时进行真菌培养、普通PCR、基因克隆和测序鉴定。对所有真菌分离株进行抗真菌药物敏感性试验。结果:研究结果显示,建立的白色念珠菌TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法专属性强,能准确检出白色念珠菌,而与其他念珠菌属真菌、非念珠菌属真菌、细菌、寄生虫和病毒均无交叉反应,特异性为100%。该技术灵敏度高,能精确定量检测白色念珠菌DNA线性范围达11个数量级,白色念珠菌最低检测限度为5个菌落形成单位。该方法重复性非常好,组内和组间相对标准偏差均小于2%。测试中相关系数、斜率和效率没有显著变化,表明该方法稳定性好,精密度高。将其成功应用于临床标本中白色念珠菌载量的定量检测,用普通PCR和基因克隆测序分析进行了确证。整个检测过程可在2 h内完成,可以用作定量分析快速诊断方法。应用TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应从1 185份临床标本中检出94份白色念珠菌阳性标本,真菌培养获得8株存活的白色念珠菌,抗真菌药物敏感性试验分析结果显示:这些白色念珠菌分离株对制霉菌素、咪康唑、克霉唑、益康唑、氟康唑、沃尔康唑均敏感,但对两性霉素B、酮康唑、特比萘芬、氟胞嘧啶已经产生了耐药性。结论:本研究新开发评价的TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链�; 高正琴岳秉飞; 关键词：白色念珠菌内转录间隔区

小鼠诺如病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用被引量：8: 2016年; 目的建立小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)实时荧光定量PCR检测方法,为建立MNV规范化检测方法提供依据。方法根据NCBI公布的60个MNV病毒株核酸序列设计特异性引物,构建标准阳性质控品,建立MNV实时荧光定量PCR方法,并进行特异性、灵敏度、重复性及稳定性评价。用该方法对766只送检小鼠的盲肠内容物样品进行检测,初步了解北京地区实验小鼠MNV感染状况。结果成功建立MNV实时荧光定量PCR检测方法,该方法特异性好,与同种属人类诺如病毒(Hu No Vs)、猫杯状病毒(FCV)均无交叉反应,检测灵敏度可达101copies/μL。批内及批间CT值变异系数均小于2%。应用该方法在766份小鼠盲肠内容物样品中检出301份MNV核酸阳性样品,阳性率39.3%。结论建立的MNV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重复性好,可以用于MNV的快速定量检测。; 高洁贺争鸣; 关键词：实时荧光定量PCR

长爪沙鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用被引量：3: 2015年; 目的建立长爪沙鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）kL体ELISA检测方法，应用于长爪沙鼠携带LCMV的检测。方法培养Vero细胞，接种LCMV毒种，制备Vero正常抗原和LCMV特异抗原，滴定酶结合物、正常抗原及特异抗原最佳工作浓度，并进行方法的特异度、灵敏度、精密性、稳定性实验。结果正常抗原、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0．4gg／mL、10gg／mL和1：5000；正常抗原、特异抗原批内变异系数分别为6．8％和8．9％，批间平均变异系数分别为9．3％和8．4％；检测灵敏度达到1：1280；与小鼠仙台病毒（SV）、小鼠呼肠孤病毒3型（Reo3）均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25％。结论建立的ELISA方法特异度、灵敏度强，重复性、稳定性好，可用于长爪沙鼠LCMV抗体的检测。; 王吉卫礼付瑞李晓波王淑菁邢进冯育芳巩薇岳秉飞贺争鸣; 关键词：ELISA 长爪沙鼠

猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)抗体ELISA检测方法的建立与初步应用被引量：5: 2014年; 目的建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)抗体ELISA检测方法,应用于临床样品中FHV-1抗体的检测。方法培养猫肾传代细胞(CRFK),接种FHV-1病毒,制备CRFK正常抗原和FHV-1特异抗原,滴定山羊抗猫IgG-HRP和抗原最佳工作浓度,并进行特异性、敏感性、稳定性及精密性实验。结果正常抗原、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0.05μg/mL、10μg/mL和1∶5 000;正常抗原、特异抗原批内变异系数分别为8.7%和5.8%,批间平均变异系数分别为11.9%和6.6%;检测灵敏度为1∶6 400;与猫细小病毒(FPV)、猫杯状病毒(FCV)均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强,可用于猫FHV-1抗体的检测。; 王吉卫礼付瑞李晓波王淑菁巩薇岳秉飞贺争鸣; 关键词：ELISA

实时荧光定量TaqMan-PCR检测小鼠多瘤病毒方法的建立: 目的建立一种快速、特异、敏感的小鼠多瘤病毒(Murine polyomavirus,MPyV)荧光定量TaqMan-PCR检测方法,用于MPyV核酸的检测。方法根据Gen Bank中小鼠多瘤病毒基因组序列设计了一对特异性...; 尹雪琴；袁文；王静；黄碧洪；饶丹；伍妙梨；朱余军；冯胜鹏；郭鹏举；张钰；黄韧；; 关键词：实时荧光定量PCR TAQMAN探针; 文献传递

猫细小病毒PCR检测方法的建立及初步应用被引量：5: 2015年; 目的建立猫细小病毒PCR检测方法,应用于猫临床样本中FPV的快速检测。方法根据已发表的FPVVP2基因序列设计合成引物,并以此建立FPV的PCR检测方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证。用建立的方法对33份猫临床样品进行检测。结果建立的FPVPCR检测方法与猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)、猫冠状病毒(FeCV)、猫合胞体病毒(FeSFV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为5lgTCID50/mL,相应的DNA模板浓度为4.9×102拷贝/μL;FPVDNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带。应用该方法从33份猫临床样本中检测出21份FPV核酸阳性。结论建立的FPVPCR检测方法具有特异、敏感及稳定的特点,适合于临床FPV的感染检测。; 王吉付瑞卫礼李晓波王淑菁巩薇岳秉飞贺争鸣; 关键词：猫细小病毒聚合酶链式反应

基于牛分枝杆菌PPD的猕猴全血IFN-γ释放试验观察被引量：1: 2016年; 目的分析全血IFN-γ释放试验在猕猴分枝杆菌检测中的应用价值。方法首先测定结核菌素试验(TST)阳性、阴性猕猴血清样本的基础IFN-γ含量。然后以PBS为对照,200 IU bovine-PPD为刺激抗原,分别与TST阴性和阳性猕猴肝素抗凝血共培养约24 h,收集血浆,测定IFN-γ含量。通过分析抗原刺激前后血浆IFN-γ含量变化和刺激指数探讨全血IFN-γ释放试验的诊断效能。结果 TST阳性猕猴血清基础IFN-γ含量明显高于TST阴性猕猴,但离散度都较大。PPD刺激前后,TST阴性猕猴血浆IFN-γ含量无明显变化,而TST阳性猕猴血浆IFN-γ含量明显升高(P<0.01)。刺激指数结果显示,TST阳性猕猴明显高于TST阴性猴(P<0.01)。ROC曲线分析表明,血浆IFN-γ含量和刺激指数均可作为全血IFN-γ释放试验的评价指标。结论本研究基于小样本量的实验结果证实,全血IFN-γ释放试验是猕猴分枝杆菌快速诊断的有益补充方法。; 闵凡贵郭羽罗挺潘金春刘助红黄树武张钰; 关键词：猕猴 PPD 分枝杆菌

肿瘤移植裸鼠粪类圆线虫感染病原和分子诊断被引量：4: 2014年; 目的肿瘤移植裸鼠粪类圆虫病诊断。方法肿瘤移植裸鼠的尸体解剖显微镜检查发现类圆线虫作形态学鉴定并采用二重PCR进行分子诊断。结果尸检发现肿瘤移植裸鼠样本中出现大量粪类圆线虫,初步确诊粪类圆线虫病,二重PCR检出样本中粪类圆线虫特定DNA进一步确诊。结论防止这种严重后果是早期诊断。肿瘤移植受体和供体应进行寄生虫感染包括类圆线虫病筛查。本研究第一个广泛报道了肿瘤移植裸鼠粪类圆虫病诊断。; 高正琴贺争鸣关伟鸿; 关键词：粪类圆线虫裸鼠

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