搜索到181篇“ PIGGYBAC转座子“的相关文章
- 基于PiggyBac转座子优化稳定表达细胞系的新型瞬时受体电位M2通道抑制剂筛选
- 2024年
- 目的:使用PiggyBac(PB)转座系统建立稳定表达瞬时受体电位M2(TRPM2)通道的人胚胎肾细胞HEK293T,并进行TRPM2通道抑制剂筛选,为治疗脑缺血等疾病寻找潜在的药物。方法:根据PB转座原理,构建pPB-hTRPM2真核表达载体。将重组质粒和辅助质粒共同转染至HEK293T细胞中,利用系统携带的荧光与膜片钳鉴定TRPM2基因表达,通过Z'因子评估细胞模型是否适用于钙成像法的高通量筛选。利用钙成像法和膜片钳对11个先导化合物分子进行初步活性评价,测定化合物分子对TRPM2通道的抑制活性。利用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤模型和细胞计数试剂盒8(CCK-8)方法验证筛选得到的化合物分子对损伤细胞的保护作用。利用流式细胞术检测细胞活性氧水平。利用小鼠短暂性大脑中动脉栓塞(tMCAO)模型评价化合物的神经保护作用。结果:成功构建pPB-hTRPM2真核表达载体,构建出可高效表达TRPM2基因的HEK293T细胞系,并同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。在筛选获得的嘌呤霉素抗性细胞中,所有细胞荧光明亮可见,诱导后细胞表现出经典的TRPM2通道电流特征,TRPM2通道电流值与瞬时转染对照组差异无统计学意义(P>0.05)。该筛选系统进行钙成像实验的Z'因子为0.5416,表明其适用于高通量筛选。通过钙成像法结合膜片钳筛选出化合物6,其具有显著的TRPM2通道抑制作用,且1.0μmol/L的化合物6能够显著提高OGD/R后SH-SY5Y细胞的存活率(P<0.05),降低活性氧水平(P<0.05),0.3、1.0 mg/kg的化合物6能降低tMCAO小鼠脑梗死体积百分比(均P<0.05)。结论:利用PiggyBac基因编辑技术成功构建了TRPM2基因稳定表达细胞系,利用钙成像法和膜片钳在候选化合物中成功筛选出一个高亲和力的新的TRPM2通道抑制剂。该抑制剂可以通过降低细胞活性氧水平缓解OGD/R后细胞损伤,并对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。
- 应凯悦华宁骆燕萍刘星宇刘敏杨巍
- 一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法及其应用
- 本发明公开了一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法及其应用，涉及基因工程技术领域，其技术要点为：所述方法包括以下步骤：S1、高效piggyBac转座系统的构建，即通用载体系统的构建；S2、利用高效piggy...
- 李利妹周斌闫宏伟连少强
- 新型PiggyBac转座子系统及其用途
- 本发明涉及PiggyBac转座子系统及其用途，具体为提供核酸构建物，其包含以下元件：转座子3’末端重复序列、第一polyA序列、具有转录终止功能的绝缘子序列、转座子5’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启...
- 金华君许馥慧黄晨马星明刘天怡
- 文献传递
- 利用PiggyBac转座子系统构建表达Δ15 Des酶活性的转基因小鼠被引量：1
- 2022年
- 必需脂肪酸为人体健康和生命所必需,但机体自身不能合成,研究表明ω-3族脂肪酸对人体的生理功能有更加积极的影响。哺乳动物体内缺乏ω-3去饱和酶的基因,来自线虫Caenorhabditis elegans的Δ15-脂肪酸去饱和酶(Δ15Des)可以将体内ω-6多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)转化为ω-3 PUFAs。利用PiggyBac转座子(PB)系统构建表达Δ15 Des酶活性的转基因小鼠可以在较短时间内繁育出稳定遗传的纯合子转基因小鼠,整合率高达35.1%。饲料中添加6%ω-6 PUFAs饲喂小鼠,通过气相色谱(gas chromatography, GC)检测小鼠体内脂肪酸的变化,荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)来检测Δ15 Des在小鼠体内的表达水平。从qPCR和GC结果分析,阳性小鼠的基因活性率为61.53%,与传统方法相比,Δ15 Des的转入效率及活性都显著提高,且纯合子比杂合子表达更高的活性,进一步验证了PiggyBac转座子系统高效的转导效率和安全稳定性。
- 王颖杨仕赛赵瑄李亚吕露露朱贵明
- 关键词：多不饱和脂肪酸转座子转基因
- 一种由piggyBac转座子介导高效构建稳定细胞株的策略被引量：2
- 2021年
- 构建稳定细胞株的关键是如何提高外源目的基因插入基因组的效率。piggyBac转座子(简称PB)通过"切离-粘贴"的机制实现在基因组上的转座,其本质是在基因组的不同位点间进行插入。利用PB转座子高效插入基因组的特性,并通过改造该转座系统,即分别在PB转座酶的3’端和5’端加入核定位信号肽,然后在人源胚胎肾293细胞系中评价改造后的PB转座子介导获得稳定细胞株的能力。结果表明,野生型PBase组的克隆形成率是对照组的6.7倍,3’NLSPBase组比野生型PBase组再提高1.3倍。利用人宫颈癌HeLa细胞进一步验证上述结果。可见,经改造后的PB转座子能够提高外源目的基因插入基因组的效率,实现高效构建稳定细胞株。
- 盛哲津王亮周斌李利妹
- 关键词：PIGGYBAC转座子
- piggyBac转座子AgoPLE1.1在黑腹果蝇种系转化中的应用
- 2021年
- 【目的】通过检测黑腹果蝇Drosophila melanogaster中piggyBac(PB)转座子AgoPLE1.1的转化活性,明确AgoPLE1.1开发为昆虫转基因载体的潜力。【方法】构建AgoPLE1.1转座酶辅助质粒pAgoHsp和带有红色荧光标记的供体质粒pXLAgo-PUbDsRed,辅助质粒和供体质粒以170 ng/μL∶400 ng/μL,90 ng/μL∶200 ng/μL和90 ng/μL∶100 ng/μL 3种不同的比例混合后分别注射新鲜的W1118黑腹果蝇胚胎,筛选注射后代中的转基因黑腹果蝇个体;利用Southern杂交验证转基因黑腹果蝇中AgoPLE1.1转座子的插入拷贝数;利用染色体步移技术克隆AgoPLE1.1插入位点旁侧序列,明确AgoPLE1.1转座子的转座特征。【结果】AgoPLE1.1转座子在黑腹果蝇中具有转化活性,转基因频率为1.32%~1.94%。Southern杂交结果显示,AgoPLE1.1转座子在黑腹果蝇中至少有6个插入位点。染色体步移法克隆了其中4个位点,分别位于黑腹果蝇的3R,3L,2L和X染色体,并且AgoPLE1.1转座子在黑腹果蝇染色体中的整合带有供体质粒的骨架。【结论】PB转座子AgoPLE1.1仅可以在黑腹果蝇中以较低的频率进行非精确的剪切和转座,不具有开发为新型昆虫转基因载体的潜力。
- 张浩淼王晓芳罗光华韩湘豫王秋霞韩召军吴敏
- 关键词：黑腹果蝇PIGGYBAC转座子剪切转座
- 基于piggyBac转座子系统制备稳定表达BE4蛋白的猪肾上皮细胞系的方法
- 本发明公开了一种稳定表达BE4蛋白的猪肾上皮细胞系的制备方法，以传代良好的猪肾上皮细胞（PK‑15）为宿主细胞，共转染含BE4融合蛋白序列的piggyBac转座子（PB‑BE4max）载体和转座酶表达载体质粒，经过嘌呤霉...
- 赵书红熊友才阮进学韩晓松庄荣志赵广兴李金虎赵长志李长春谢胜松李新云
- 文献传递
- 一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法
- 本发明提供一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，包括步骤：1)构建PB[tet‑on‑SD]载体，包含piggyBac缺陷转座子、反式四环素调控激活因子rtTA表达框和受tetO操纵子调控启动的剪接供体；2)将P...
- 潘雨堃
- 纳米载体介导的PiggyBac转座子制备CAR-NK细胞被引量：3
- 2020年
- 目的:探索新型阳离子聚合物纳米载体mPEG-P(Asp-AED-g-HFB)(PAEF)和PiggyBac转座子介导嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰自然杀伤(natural killer,NK)细胞的基因转染方法,为肿瘤细胞免疫治疗制剂研发提供新策略。方法:制备PAEF/DNA(转座酶+转座子)复合物,通过Nano-ZSE动态光散射系统(Malvern Instruments)测量PAEF/DNA复合物的粒径分布和表面电位;DNA凝胶电泳验证PAEF的DNA包封率、释放性和稳定性,结合粒径电位选择进入细胞合适的N/P值;CCK-8细胞毒性实验分析不同N/P值条件下PAEF/DNA复合物的细胞毒性;荧光显微镜及流式细胞术检测细胞转染效率,评估PAEF基因转染载体的可行性。结果:PAEF可包裹DNA形成粒径100~150 nm的纳米复合物,后者易于介导DNA进入细胞;当N/P值为20时,PAEF即可实现DNA的完全包裹;在还原剂二硫苏糖醇(dithiothreotol,DTT)存在下,PAEF对DNA有良好的释放能力;N/P值为80时,PAEF/DNA复合物转染组的NK-92细胞存活率显著高于脂质体转染组[(72.50±3.9)%vs(64.03±1.8)%,P<0.05];荧光显微镜下观察发现,PAEF/DNA组荧光多、荧光强度大;流式细胞术显示最高转染效率为83.4%。结论:纳米载体PAEF通过静电吸附作用能够很好地包裹DNA,且生物相容性好,基因转导效率较高,成功制备的CAR-NK细胞为过继免疫治疗提供良好的实验基础。
- 岳冉刘子洋郑岩陆小丹胡珊珊张炳勇李修岭李景果韩双印
- 关键词：PIGGYBAC转座子肿瘤免疫治疗
- 纳米载体介导的PiggyBac转座子制备CAR-NK细胞
- 背景过继免疫疗法(adoptive immunotherapy,AIT)是近年来迅速发展的恶性肿瘤治疗方法,嵌合抗原受体(chmeric antigen receptor,CAR)修饰免疫细胞尤其取得显著成果。细胞免疫疗...
- 岳冉
- 关键词：PIGGYBAC转座子肿瘤免疫治疗
- 文献传递
