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HBxAg反式调节基因11剪切体的克隆化及生物信息学分析: 2011年; 目的克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白反式调节的靶基因11(XTP11),获得未知功能的新基因-XTP11剪切体,对其进行生物信息学分析,探讨其结构和功能。方法从肝母细胞瘤细胞系HepG2中提取总RNA,逆转录为cDNA后,设计特异性引物克隆XTP11剪切体,生物信息学技术获得编码序列、物理化学性质、蛋白质结构和功能等基本信息。结果成功扩增出XTP11剪切体基因,生物信息学分析推定ORF为1 314个核苷酸,编码产物为437个氨基酸残基。结论此文发现并鉴定了HBV XTP11剪切体,为阐明其在HBV X蛋白致病机制中的作用提供新的研究线索。; 尹丽林原唐泽耀成军; 关键词：剪切体克隆化生物信息学

应用基因表达谱芯片技术筛选HCV p7蛋白反式调节基因: 2010年; 目的应用基因芯片技术对pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-p7分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,筛选能被HCV p7蛋白反式调节的靶基因,研究p7蛋白的生物学功能。方法以含有HCV全基因组的pBRTM质粒作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增p7蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-p7。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并逆转录成cDNA,进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中,有1个基因表达水平显著上调,22个基因表达水平显著下调。结论 HCV p7蛋白是一种反式调节因子,p7基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。; 郭江成军洪源王琦邢卉春毛羽; 关键词：丙型肝炎病毒反式调节

乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活蛋白2结合蛋白1基因的克隆及其反式调节基因的筛选: 2010年; 目的克隆HBV前S1蛋白反式激活蛋白2结合蛋白I（PS1TP2BP1）基因，并筛选与其相互作用的反式激活基因。方法应用聚合酶链反应（PCR）扩增PS1TP2BP1基因，鉴定正确后再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA^TM 3．1／myc-His A上；以真核表达质粒pcDNA^TM 3．1／myc HisA—PS1TP2BP1转染HepG2细胞，构建cDNA消减文库；进行测序及同源性分析。结果从HepG2细胞来源的cDNA中扩增出PS1TP2BP1基因，并成功进行TA克隆，酶切、测序均正确后，成功构建真核表达重组体。消减文库扩增后得到35个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到15个含200～1000bp插入片段的菌落。对所得片段测序，并进行同源性分析，显示15种已知基因编码蛋白可能是PS1TP2BP1反式激活靶基因。结论成功克隆PS1TP2BP1，并构建了PS1TP2BP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定了基础。; 张桓虎王丹琼成军赵婕赵心恺高虹; 关键词：肝炎病毒乙型抑制性消减杂交

在肝母细胞瘤中筛选XTP6的反式调节基因及其意义: 2009年; 目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建XTP6反式激活相关基因差异表达的cDNA文库,筛选XTP6蛋白反式激活相关基因。方法:构建XTP6真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP6,并将其转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;48h后收获细胞后提取mRNA并逆转录成cDNA,tester cDNA经RsaI酶切消化后分成两组,分别与两种不同接头衔接,再与过量的driver cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR反应,第二次PCR产物与pGEM-Teasy克隆载体连接,构建cDNA消减文库,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果:成功构建人XTP6蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库。扩增后得到70个200-1000bp插入片段的克隆,随机挑选其中20个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得11种已知功能编码基因。结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞周期调节、生物代谢和炎症修复密切相关的蛋白编码基因。; 张雷马清涌孟宪魁李康成军; 关键词：乙型肝炎病毒抑制性消减杂交

应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ABP37的反式调节基因被引量：1: 2009年; 目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建NS5ABP37反式激活相关基因差异表达的cDNA文库,筛选NS5ABP37蛋白反式激活相关基因。方法以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ABP37转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,从转染后的细胞裂解液中提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切消化后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR反应;第2次PCR产物与pGEM-Teasy克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果成功构建了人NS5ABP37蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库。扩增后得到60个200～1000bp插入片段的克隆,随机挑选其中20个测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得9种已知功能编码基因。结论NS5ABP37基因功能涉及细胞生长调节、信号转导和能量代谢。; 张雷马清涌孟宪魁李康成军; 关键词：抑制性消减杂交丙型肝炎病毒 CDNA文库

乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因11剪切体的原核表达及蛋白纯化: 2009年; 目的克隆乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因11(XTP11)剪切体,构建其原核表达载体,表达并纯化该蛋白。方法应用逆转录聚合酶链反应及生物信息学技术从HepG2细胞中提取cDNA为模板并扩增,意外获得XTP11基因的剪切体基因,选用pGEM-T载体进行T-A克隆,通过限制性酶切分析及测序鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌,经异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导XTP11剪切体融合蛋白的表达,表达产物进行SDS-PAGE分析,考马斯亮蓝染色,以鼠His probe单克隆抗体进行Western blot分析鉴定证实表达蛋白的特异性,并纯化蛋白。结果成功扩增出XTP11剪切体基因,构建了pET-32a(+)XTP11剪切体原核表达载体,经IPTG诱导获得了大小约为69kD的重组蛋白。结论发现的HBV XTP11剪切体及其融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。; 尹丽成军王琦李越林原; 关键词：乙型肝炎病毒剪切体基因克隆原核表达

乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因11剪切体的克隆表达和功能研究: 研究背景与目的：我国是乙型肝炎与肝癌的高发区。乙型肝炎病毒（HBV）X基因及其编码的多功能蛋白HBx是乙型肝炎病毒基因转录的必须因子，与乙型肝炎和肝细胞癌的发生关系十分密切。本研究通过寡核苷酸基因芯片技术和生物信息学分析...; 尹丽; 关键词：乙型肝炎病毒肝细胞癌克隆表达生物信息学亚细胞定位; 文献传递

应用抑制性消减杂交技术筛选HCV p7TP2反式调节基因: 2008年; 目的应用抑制性消减杂交技术筛选HCV p7TP2反式调节基因。方法采用实时定量PCR验证HCV p7下调p7TP2基因的表达,并应用抑制性消减杂交技术筛选并构建p7TP2下调表达基因的消减文库。用活细胞发光法检测p7TP2基因抑制Huh-7细胞系的增殖。结果经同源性分析p7TP2下调表达的基因主要位于线粒体,并与细胞凋亡有关。p7TP2基因转染的Huh-7细胞的活性被显著抑制。结论p7TP2基因功能的研究为HCV致病机制的研究奠定了基础。; 袁菊成军洪源陶明亮靳亚平李越李康杨延平; 关键词：实时定量PCR 细胞凋亡丙型肝炎病毒

乙型肝炎病毒前S1蛋白反式调节基因2的克隆、表达及功能被引量：5: 2008年; 目的应用原核表达系统表达HBV前S1蛋白反式调节基因2（PS1TP2），酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与之结合的蛋白质，了解该基因产物在肝癌细胞系中的亚细胞定位。方法应用生物信息学初步探讨PS1TP2结构及功能。PCR扩增PS1TP2基因，构建pET32a（＋）-PS1TP2表达载体，在大肠埃希菌Rosettap中进行诱导表达。构建pGBKT7-PS1TP2重组载体，应用酵母双杂交技术，在营养缺陷型培养基上筛选白细胞cDNA文库中与之结合的蛋白质。构建pEGFPC1-PS1TP2表达质粒，转染肝癌细胞株HepG2，利用荧光显微镜和共聚焦显微镜观察PS1TP2的亚细胞分布。结果PS1TP2基因位于6q24．1，疏水指数较高。PS1TP2能在原核系统中表达，表达产物相对分子质量约4．1×10＾4。酵母双杂交技术筛选出白细胞cDNA文库中与之结合的蛋白质26个。PS1TP2亚细胞定位于细胞质中。结论在原核表达系统中成功表达了PS1TP2，为抗体的制备奠定了基础。PS1TP2可与白细胞表达的某些蛋白质相互作用，在肝癌细胞系中定位于细胞质，为进一步探究HBV感染的发病机制提供了新线索。; 王丹琼郭江成军张健康赵龙凤洪源张黎颖; 关键词：生物信息学原核表达酵母双杂交

应用抑制性消减杂交技术筛选转化生长因子β1刺激LX02细胞的反式调节基因被引量：4: 2008年; 目的构建转化生长因子（TGF）β1刺激大鼠肝星状细胞（LX02）反式调节基因的cDNA消减文库，筛选并克隆TGFβ1反式调节相关基因，以阐明TGF β1介导肝纤维化的分子生物学机制。方法以TGFβ1刺激LX02细胞，同时以磷酸盐缓冲液刺激的LX02细胞作为对照。提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa I酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应。将产物与pGEM-Teasy载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增；随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建了TGF β1刺激LX02细胞反式调节基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到146个200～1000bp插入片段的阳性克隆；随机挑取其中35个克隆进行测序，30个列序成功，并通过生物信息学分析发现有28个与已知基因序列和2个与未知功能基因序列高度同源。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了TGF β1刺激LX02细胞反式调节基因的cDNA消减文库，筛选到一些与细胞生长调节、蛋白质合成、信号传导、细胞外基质代谢、抗脂质过氧化等密切相关的蛋白质编码基因，为进一步阐明TGFβ1介导肝纤维化的分子生物学机制提供了线索。; 肖琳成军郭江张黎颖洪源伦永志蓝贤勇武会娟张丽娟张跃新张建龙李燕; 关键词：肝纤维化肝星状细胞转化生长因子Β

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