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纤维微菌β-1,3-葡聚糖酶的克隆表达及对灵芝细胞壁的水解作用
2023年
该文旨在研究一种酶解灵芝(Ganoderma lucidum)菌丝体从而提高其胞内蛋白提取效率的方法。通过PCR方法扩增获得纤维微菌(Cellulosimicrobium sp.)CICIM6906的β-1,3-葡聚糖酶编码基因,该基因命名为bgl6906并与表达载体连接,构建重组质粒pET28a-bgl6906,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-bgl6906。重组菌在TB培养基中进行诱导表达,表达产物在自身信号肽引导下大部分分泌到细胞外。以茯苓多糖为底物时,重组酶BGL6906纯酶比酶活力为567.8 U/mg,最适pH为5.5,最适温度为50℃。重组菌在15 L发酵罐中发酵72 h胞外酶活力达到67 U/mL。重组酶BGL6906与果胶酶交替水解灵芝菌丝体培养物,可以有效水解细胞壁,获得部分原生质体。进一步辅助短时超声波破碎可以大幅度提高灵芝胞内产物的释放。
杨梦莲单逸蓝沈微朱新文杨海泉陈献忠陈磊夏媛媛
关键词:Β-1,3-葡聚糖酶分泌表达灵芝细胞破碎
The plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase gene GhPdBG regulates fiber development in cotton
2023年
Trichomes are specialized structures that originate from epidermal cells of organs in higher plants.The cotton fiber is a unique single-celled trichome that elongates from the seed coat epidermis.Cotton(Gossypium hirsutum)fibers and trichomes are models for cell differentiation.In an attempt to elucidate the intercellular factors that regulate fiber and trichome cell development,we identified a plasmodesmal β-1,3-glucanase gene(designated GhPdBG)controlling the opening and closing of plasmodesmata in cotton fibers.Structural and evolutionary analysis showed haplotypic variation in the promoter region of the GhPdBG gene among 352 cotton accessions,but high conservation in the coding region.GhPdBG was expressed predominantly in cotton fibers and localized to plasmodesmata(PD).Expression patterns of PdBG that corresponded to PD permeability were apparent during fiber development in G.hirsutum and G.barbadense.The PdBG-mediated opening-closure of PD appears to be involved in fiber development and may account for the contrasting fiber traits of these two species.Ectopic expression of GhPdBG revealed that it functions in regulating fiber and trichome length and/or density by modulating plasmodesmatal permeability.This finding suggests that plasmodesmal targeting of GhPdBG,as a switch of intercellular channels,regulates single-celled fiber and trichome development in cotton.
Yijie FanShuangshuang LinYanhui LyuHaihong ShangYoulu YuanZhengmin TangChengzhi JiaoAiyun ChenPiyi XingLi ZhangYuxiao SunHaixia GuoTongtong LiZhonghai RenFanchang Zeng
关键词:Β-1,3-GLUCANASE
大麦叶斑病菌侵染过程及几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性变化的研究被引量:2
2023年
【目的】探究叶斑病菌Bipolaris sorokiniana对大麦叶片的侵染过程。【方法】以大麦感病品种蒙啤1号(MP1)和抗病品种蒙啤3号(MP3)为材料,接菌后,并在不同时间采集MP1发病叶片制做切片,结合石蜡切片和扫描电镜观察叶斑病病原菌对大麦叶片的侵染过程。【结果】接菌后,MP1和MP3中的CHT和β-1,3-GA的活性均高于对照,且MP3中的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性要高于MP1。孢子在接种12~24 h后开始萌发,顶端长出长短不一的芽管;接种36 h后,菌丝伸长且向细胞间隙处直接侵入大麦叶片表皮细胞内,组织内部的孢子主要分布在维管束中;接种4~5 d后,菌丝快速产生分枝,呈网状扩散,叶片表面形成密集的菌丝网,叶片外部出现明显病斑;接种7~14 d后,叶片表皮的孢子明显减少,在维管束组织中存在孢子。【结论】病原菌从细胞间隙侵入可能是该病侵入的主要途径,孢子萌发后形成菌丝进入组织,再向其他部位蔓延,病原菌侵入后期寄主表面菌丝形成网状结构。
杨庆丽张毅祁天涛曲洁琼汪军成姚立蓉司二静马小乐李葆春王化俊孟亚雄
关键词:大麦叶斑病酶活性石蜡切片
β-1,3-葡聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达与性质被引量:1
2022年
藤黄节杆菌(Athrobacter luteu)β-1,3-葡聚糖酶(βglⅠ)能够特异性的作用于β-葡聚糖中的β-1,3-糖苷键,在酵母裂解活性上具有突出优势,但是βglⅠ在生产上存在表达低、生产成本高的问题。作者利用无缝克隆技术构建表达载体,实现了βglⅠ在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,并通过比较不同Tat类型和Sec类型信号肽、RBS、5′UTR等表达元件来提高βglⅠ的胞外产量。结果表明,信号肽SPLipA使得βglⅠ表达水平提高了0.4倍,在此信号肽基础上继续比较各RBS和5′UTR序列,其中cry3A 5′UTR使βglⅠ产量高出出发菌株1.2倍。此外,利用Ni2+亲和层析柱纯化βglⅠ并对其酶学性质进行研究,结果表明该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0,在0~45℃、pH 4.0~9.0的范围内稳定性较好,比活为973 U/mg。
张佳妮徐岩喻晓蔚
关键词:枯草芽孢杆菌分泌表达信号肽
基因突变提高毕赤酵母表达内切β-1,3-葡聚糖酶活性
2021年
为构建一株高效表达内切β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母菌株,并用于水解热凝胶生产β-1,3-葡寡糖。作者首先对哈茨木霉来源内切β-1,3-葡聚糖酶基因进行随机突变,并构建BGN13.1a突变库;然后采用高通量技术及刚果红平板筛选高表达菌株;最后采用TLC薄层色谱和MALDI-TOF MS分析热凝胶水解产物,并分析了酶学性质。结果表明,本研究成功筛选得到毕赤酵母突变株K827,酶活较初始菌株提高了25%;其水解产物聚合度为2~10,且寡糖产量为1.492 g/L;其最适pH与最适温度分别为5.5和50℃;相较亲本酶,突变株K827的pH稳定性与温度稳定性都有明显提高。本研究为内切β-1,3-葡聚糖酶的工业化生产及应用提供依据。
金树霞王力朱莉李菲菲刘丽萍詹晓北郑志永高敏杰
关键词:毕赤酵母易错PCR酶学性质
烟草β-1,3-葡聚糖酶的特性和结构分析
2018年
[目的]对烟草β-1,3-葡聚糖酶的特性和结构进行分析。[方法]以烟草为材料,采用PROTSCALE、Target P 1.1、NPSA-PRABI和SWISS-MODEL工具分别测定烟草葡聚糖酶的疏/亲水性、亚细胞定位、二级结构和三级结构。[结果]NtBGl属于亲水性蛋白,NtBGl-1和NtBGl-2的疏/亲水性较为相似,N端和中部区域的疏水性较强,NtBGl-3以N端的疏水性较强;NtBGl均含有信号肽,且其切割位点分别位于第2132和29位氨基酸处,NtBGl-1和NtBGl-2定位于液泡,NtBGl-3定位于细胞外;NtBGl的二级结构均以α-螺旋比例最大,依次为36.21%、35.14%、35.28%,三级结构呈现"C"型。[结论]该研究可为有效发挥烟草葡聚糖酶的功能特性奠定基础。
刘彪杨柳罗万麟赵爽殷雪艳
关键词:烟草Β-1,3-葡聚糖酶
烟草β-1,3-葡聚糖酶的生物学分析被引量:1
2018年
[目的]以烟草β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列为材料,对其特性进行深度挖掘。[方法]采用NCBI-PROTEIN筛选蛋白序列,依次运用Prot Param、Signal P 4.1和TMHMM 2.0工具进行预测并分析烟草葡聚糖酶的理化特性、信号肽和跨膜结构的组成成分。[结果]NtBGl-2的分子量最大(40 390.76 Dk),NtBGl-3的分子量最小(37 722.64 Dk);NtBGl-1和NtBGl-2的等电点小于7.0,而NtBGl-3的等电点大于7.0;NtBGl-1和NtBGl-2属于不稳定蛋白,NtBGl-3属于稳定性蛋白,且耐热性大于NtBGl-1和NtBGl-2;NtBGl-1和NtBGl-2的优势氨基酸为甘氨酸和丝氨酸,NtBGl-3的为天冬酰氨和丙氨酸;NtBGl均含有信号肽,属于分泌蛋白;NtBGl-1无跨膜区,而NtBGl-2(13~35)和NtBGl-3(7~29)含有跨膜结构区域,属于跨膜蛋白。[结论]该研究为深入研究烟草葡聚糖酶奠定基础。
马世明罗家佐王德勋户艳霞范志勇苏家恩
关键词:烟草Β-1,3-葡聚糖酶生物学
链格孢菌侵染采后甜瓜果实组织几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因表达分析被引量:11
2018年
以伽师瓜(抗病性强)和86-1甜瓜(抗病性一般)果实为实验材料,研究链格孢菌(Alternaria alternata)侵染后几丁质酶(chitinase,CHT)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-{3},GLU)基因表达规律。甜瓜果实接种A.alternata,7℃贮藏,测定病斑大小,荧光定量聚合酶链式反应测定CmCht1、CmCht2和CmGlu相对表达量。结果表明:伽师瓜和86-1甜瓜接种A.alternata,在侵染9 d时出现病斑,9~24 d病斑直径不断扩大,86-1甜瓜病斑直径大于伽师瓜,侵染24 d时86-1甜瓜病斑直径是伽师瓜的1.12倍,伽师瓜对A.alternata侵染的抵抗能力要强于86-1甜瓜。在侵染期间,伽师瓜和86-1甜瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu相对表达量显著提高,呈先升高后降低的变化趋势,伽师瓜和86-1甜瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu相对表达量最高峰出现时间分别相差3、6、3 d,伽师瓜CmCht1、CmCht2相对表达量始终高于86-1甜瓜,CmGlu相对表达量在侵染12~24 d高于86-1甜瓜。在侵染期间CmCht1、CmCht2和CmGlu表达规律存在差异,侵染前期CmCht1、CmCht2相对表达量较高,侵染中期和后期CmGlu相对表达量较高;A.alternata侵染前期主要诱导了CHT基因的表达,中期和后期主要诱导了GLU的基因表达,CHT和GLU的基因协同表达,起到抗病性的作用。伽师瓜抗病性强于86-1甜瓜与CHT和GLU的基因的表达密切相关。
白羽嘉张培岭黄伟冯作山李梦
关键词:甜瓜链格孢菌几丁质酶3-葡聚糖酶
草菇exo-β-1,3-葡聚糖酶基因可变剪接体的克隆与表达分析
2018年
可变剪接是基因表达调控的一种重要方式。本研究利用RT-PCR克隆鉴定到草菇exo-β-1,3-葡聚糖酶基因(exg2)的4种可变剪接体(exg2V1,exg2V2,exg2V3和exg2V4),其中,exg2V1第7个内含子保留;exg2V2第11个内含子保留同时剪切掉第12个外显子的后58bp;exg2V3同时保留第7个和第17个内含子;exg2V4同时保留第2、第9和第17个内含子。4种剪接体均在可变剪接位点提前出现终止密码子,导致预测编码的氨基酸序列中包含不完整的结构域。定量PCR结果显示:草菇5个发育时期中,4种可变剪接体表达量均比标准剪接体exg2低,但4种可变剪接体的表达也表现出一定的时期和组织差异性。初步推断发现的草菇exg2基因4种可变剪接体均为无义介导的mRNA降解,通过此方式达到对exg2基因标准剪接转录本的精准调控。
陶永新仝宗军邵颜平严俊杰黄千慧谢宝贵
关键词:可变剪接子实体发育定量PCR
金针菇外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因鉴定及在不同发育时期的差异表达被引量:2
2018年
金针菇具有很高的营养与保健价值,菌柄长短决定金针菇的产量与品质,而菌柄伸长的相关作用酶及分子机理尚不清楚。前期草菇中发现外切-β-1,3-葡聚糖酶基因(exg2)可能与菌柄伸长相关,但在金针菇中尚没有exg基因的相关报道。本研究首先在金针菇全基因组中鉴定到3个外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因(分别命名为:Ffexg1、Ffexg2、Ffexg3),并进行了克隆验证。进一步采用定量PCR对3个基因在金针菇不同发育时期及组织部位的差异性表达进行了分析。结果显示:Ffexg1只在菌柄中高表达,Ffexg2与Ffexg3在菌柄中表达量先上升后下降,在菌盖中呈逐渐上升趋势。3个Ffexg基因均在菌柄发生伸长的部位表达量较高,且在菇体水平放置后菌柄弯曲程度较大的部位表达量较高。结果显示金针菇exg家族3个基因存在时空差异性表达,在菌柄中伸长较快的时期及部位伴随着Ffexg基因的高表达。结合其功能预测,Ffexg家族基因可能作用于细胞壁成分β-1,3-葡聚糖链,从而在金针菇菌柄及菌盖发育中起作用。
陶永新段静怡仝宗军严俊杰宋寒冰谢宝贵